A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 ⁻⁴ , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 ⁻³⁴ , Esrrb = 10 ⁻²⁵ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 ^-45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 ^-4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 ^-34 и 10 ^-25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 ⁻⁴⁵ ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 ^-2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 ^-2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 ^-5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 ⁻⁵ ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 ⁻⁵ , день 4 = 10 ⁻⁸ , день 5 = ​​10 ⁻¹⁰ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 ⁻¹¹ , день 4 = 10 ⁻¹¹ , день 5 = ​​10 ⁻¹³ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 ⁻⁵ , 10 ⁻⁸ и 10 ⁻¹⁰ соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 ⁻¹¹ , 10 ⁻¹¹ и 10 ^{— 13} соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 ⁻⁵ , E2A = 10 ⁻²² ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 ⁻⁶ ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 ⁻²² ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 ^-6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq ^™ v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 ⁻⁴ , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 ⁻³⁴ , Esrrb = 10 ⁻²⁵ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 ^-45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 ^-4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 ^-34 и 10 ^-25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 ⁻⁴⁵ ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 ^-2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 ^-2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 ^-5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 ⁻⁵ ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 ⁻⁵ , день 4 = 10 ⁻⁸ , день 5 = ​​10 ⁻¹⁰ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 ⁻¹¹ , день 4 = 10 ⁻¹¹ , день 5 = ​​10 ⁻¹³ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 ⁻⁵ , 10 ⁻⁸ и 10 ⁻¹⁰ соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 ⁻¹¹ , 10 ⁻¹¹ и 10 ^{— 13} соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 ⁻⁵ , E2A = 10 ⁻²² ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 ⁻⁶ ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 ⁻²² ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 ^-6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq ^™ v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 ⁻⁴ , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 ⁻³⁴ , Esrrb = 10 ⁻²⁵ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 ^-45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 ^-4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 ^-34 и 10 ^-25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 ⁻⁴⁵ ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 ^-2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 ^-2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 ^-5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 ⁻⁵ ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 ⁻⁵ , день 4 = 10 ⁻⁸ , день 5 = ​​10 ⁻¹⁰ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 ⁻¹¹ , день 4 = 10 ⁻¹¹ , день 5 = ​​10 ⁻¹³ ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 ⁻⁵ , 10 ⁻⁸ и 10 ⁻¹⁰ соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 ⁻¹¹ , 10 ⁻¹¹ и 10 ^{— 13} соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 ⁻⁵ , E2A = 10 ⁻²² ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 ⁻⁶ ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 ⁻²² ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 ^-6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq ^™ v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

Сходства и различия между…

Сходства и различия между функциями и развитием Т-хелперных (Th) клеток…

Сходства и различия между функциями и развитием субпопуляций Т-хелперных (Th) клеток и врожденных лимфоидных клеток (ILC). (A) Подмножества Th-клеток и ILC экспрессируют идентичные наборы эффекторных цитокинов и имеют схожие основные факторы транскрипции для их развития и функций. Клетки Th2 и ILC1 важны для защитного иммунитета против вирусов, внутриклеточных бактерий и простейших. Клетки Th3 и ILC2 важны для избавления от гельминтов. Клетки Th27 и ILC3 имеют решающее значение для защитных иммунных ответов против грибков и внеклеточных бактерий. Th3 и ILC2 участвуют в аллергическом воспалении, а Th-клетки 1 и 3 типа и ILC вносят вклад в аутоиммунитет.(B) В тимусе RORγt необходим для выживания CD4 ⁺ CD8 ⁺ двойных положительных (DP) клеток и реаранжировки TCRα. CD4 ⁺ CD8 ⁺ DP тимоциты могут развиваться в наивные CD4 ⁺ Т-клетки, наивные CD8 ⁺ Т-клетки, NKT-клетки и tTreg-клетки посредством индукции ThPOK, Eomes, PLZF и Foxp3 соответственно. GATA3 регулирует экспрессию ThPOK и, таким образом, имеет решающее значение для развития CD4, но не CD8, Т-клеток. После активации Т-клеток наивные CD4 ⁺ Т-клетки могут далее развиваться в T-bet-экспрессирующие Th2, GATA3-экспрессирующие Th3 и RORγt-экспрессирующие Th27 клетки.С врожденной стороны, клетки-предшественники NK / ILC, экспрессирующие фактор транскрипции TCF7, могут развиваться в экспрессирующие Eomes обычные NK-клетки, RORγt-экспрессирующие LTi или LTi-подобные клетки и PLZF ⁺ GATA3 ^hi Id2 ^hi предшественники ILC. . GATA3 имеет решающее значение для генерации предшественников ILC PLZF ⁺ GATA3 ^hi Id2 ^hi , но не NK-клеток. PLZF ⁺ GATA3 ^hi Id2 ^hi Предшественники ILC могут далее развиваться в экспрессирующие T-bet ILC1, GATA3 ^hi ILC2 и RORγt-экспрессирующие ILC3.Клетки Th27, экспрессирующие RORγt, или ILC3 могут дополнительно экспрессировать T-bet, превращаясь в клетки Th2 * с двойной экспрессией RORγt / T-bet или NKp46 ⁺ ILC3. ILCP, предшественник ILC.

определение, произношение, транскрипция, словоформы, примеры

существительное

мастер скрипки
один из старых мастеров

глагол

Она выучил японский менее чем за два года

Ее боль полностью преодолела ее
Методы могут справиться с проблемами

прилагательное

Дополнительные примеры

Как раб от него требовалось беспрекословно выполнять приказы своего господина.

Собака всегда подчинялась своему хозяину.

Она мастер своего дела.

… считали себя принадлежащими к высшей расе человечества …

… мастер, изготавливающий изысканную деревянную мебель по собственному проекту …

В колледже она освоила французский язык.

Он полон решимости овладеть каждым аспектом бизнеса.

Собака спасла жизнь своему хозяину.

В этом молодом, малоизвестном претенденте чемпион нашел своего хозяина.

Первый помощник учился, чтобы стать мастером.

Он настоящий лжец.

Сохраните одну копию в качестве эталона для справки, а остальные разошлите.

Вы должны научиться управлять своим темпераментом.

Глубокая скорбь овладевает мной.

Он никогда не мог овладеть математикой.

Формы слова

глагол
I / you / we / they: master
he / she / it: masters
причастие настоящего времени: освоение
прошедшее время: освоено
причастие прошедшего времени: освоено

существительное
единственное число: мастер
множественное число: мастера

Генерировать кДНК для ПЦР в реальном времени

Приложения

Выберите правильный набор PrimeScript для ОТ-ПЦР в реальном времени:

Комори, Х. et al. α (1) -Кислый гликопротеин активирует CD163 через белковый путь TLR4 / CD14: возможная защита от окислительного стресса, вызванного гемолизом. J. Biol. Chem. 287, 30688–700 (2012).

Лю, Х. et al. Метаболизм и фармакокинетика мангиферина у обычных крыс, крыс без псевдозеродышек и крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом. Drug Metab. Dispos. 40, (2012).

Шимура Ю., Сираива Ю. и Судзуки И.Характеристика субдоменов в N-концевой области гистидинкиназы Hik33 в cyanobacterium Synechocystis sp . PCC 6803. Physiol растительных клеток. 53, 1255–66 (2012).

Tani, H. et al. Полногеномное определение стабильности РНК выявляет сотни короткоживущих некодирующих транскриптов у млекопитающих. Genome Res. 22, 947–56 (2012).

Yasuhara, K. et al. Отсутствие фактора транскрипции теплового шока 1 замедляет рост атрофированной камбаловидной мышцы у мышей. J. Appl. Physiol. 111, 1142–9 (2011).

Zhan, Y. et al. Новое производное таспина, HMQ1611, подавляет рост клеток рака груди через сигнальные пути рецептора эстрогена α и рецептора EGF. Рак Пред. Res. (Фила). 5, 864–73 (2012).

Zhang, X. et al. Редкий аллель OsPPKL1, связанный с длиной зерна, вызывает очень крупные зерна и значительное повышение урожайности риса. Proc. Natl. Акад.Sci. США 109, 21534–9 (2012).

Дополнительная информация о продукте

Информацию об условиях хранения, компонентах продукта и технических характеристиках см. В Сертификате анализа продукта. Пожалуйста, см. Список компонентов комплекта, чтобы определить компоненты комплекта. Сертификаты анализа и списки компонентов комплекта находятся на вкладке «Документы».