Содержание

Резюме — Мастер транскрибации в Москве

Похожие резюме

Елена Сергеевна

Город

Москва local_shipping

Возраст

41 год ( 6 февраля 1980)

Опыт работы:

5 лет и 3 месяца

Последнее место работы:

Бухгалтер, ИП Большаков
05.2009 — 12.2010

Елена Владимировна

Город

Москва

Возраст

35 лет (17 мая 1986)

Опыт работы:

4 месяца

Последнее место работы:

кредитный эксперт, ЗАО КБ»ПриватБанк»

02.2008 — 06.2008

Татьяна Васильевна

Город

Москва

Возраст

39 лет (25 июля 1982)

Опыт работы:

16 лет

Последнее место работы:

Финансовый менеджер, ООО «Байкал-Сервис ТК»
11.2007 — по текущее время

Все похожие резюме

Транскрибация ОК! — Оплата

Человека, который выполняет расшифровку речи в текст, называют транскрибатором или мастером транскрибации или транскрайбером. Мне ближе и милее слово транскрайбер, оно более легкое и изящное, а транскрибатор у меня ассоциируется с огромным железным экскаватором.

Слово транскрайбер звучит на западный манер, но на самом деле за рубежом специалистов, занимающихся этой работой, называют транскрипционистами. Однако от изменения названия суть работы не меняется. Человек слушает, что говорит, например, ведущий вебинара и набирает это в текст.

Меня как транскрайбера при согласовании технического задания с клиентом интересуют ответы на вопросы ниже.

Если Вам удобно, Вы можете скачать, заполнить файл Бриф по оказанию услуг транскрибации и прислать мне по электронной почте  [email protected]

  

Основные вопросы к заказчику моих услуг:

  1. У Вас аудио или видеозапись для расшифровки?
  2. Сколько минут содержится в Вашем материале?
  3. Вам сделать обычную расшифровку, дословную или с редактированием? Это задается выбором услуги при формировании заказа. Ваши уточнения Вы можете описать в комментариях.
  4. Надо ли вставлять тайм-коды? Если да, то с каким промежутком? Формат меток, подходящий для Вас (мин:сек или чч:мин:сек)? Неразборчивые места будут помечены символами (нрзб) с простановкой рядом тайм-кода бесплатно.
  5. Требуется ли вставлять в транскрипт текст с картинок, со слайдов или сами картинки?
  6. Каково качество Вашей записи, содержит ли она посторонние шумы?
  7. Сколько человек говорит в записи, если известно, и как их обозначить?
  8. Есть ли у Вас дополнительные требования к оформлению? Обычно я набираю тексты шрифтом Times New Roman 12.
  9. Является ли файл конфиденциальным? Если да, то предоставляется гарантия того, что все материалы будут удалены.
  10. Какой способ оплаты Вы предпочитаете?

Если Вам удобнее внести предоплату 100%, в этом случае Вы сразу получите готовый транскрипт без промежуточного скриншота.

Заказ на мои услуги вы можете сделать с этого сайта, нажав на любую кнопку. 

Ваше письмо автоматически придет на мой E-mail [email protected] На Ваш почтовый ящик после заказа придет сообщение о том, что Вы сделали заказ, и внизу будет написано: «Спасибо за заказ! Наш менеджер свяжется с Вами в ближайшее время». Не удивляйтесь, это стандартное сообщение от Nethouse, на чьей платформе создан сайт. На самом деле я работаю одна, сама являюсь и менеджером, и создателем этого сайта. Большие файлы лучше посылать мне непосредственно на электронную почту.

Если я не отвечу Вам в течение получаса, значит я не за компьютером. Для ускорения моего ответа можете прислать мне сообщение по WHATSAPP, TELEGRAM или SMS.

Центр культуры : АлтГТУ

Повышение квалификации:

с 9 июня по 9 июля 2020 года — обучалась в Академии заработка в интернете 50+ и получила  следующие сертификаты:

«Мастер Транскрибации». Диплом №2972 от 18 июня 2020 г.

«Специалист службы заботы о клиентах». Диплом №3103 от 27 июня 2020 г.

«Специалист колл-центра». Диплом №3200 от 5 июля 2020 г.

«Мастер Написания Текстов». Диплом №3259 от 8 июля 2020 г.

с 23 июля по 22 августа 2019 года обучалась в Автономной некоммерческой организации «Академия дополнительного профессионального образования» по программе повышения квалификации: «Современные подходы к управлению в сфере культуры и искусства: управленческие компетенции, экономическое и правовое регулирование»  и получила свидетельство о дополнительном образовании, сдав все зачёты и экзамен  на «отлично». 

доцент кафедры РиК до 01.09.2010г. Окончила Томский государственный университет в 1974 г. по специальности «История. Преподаватель истории и обществоведения». Стаж работы с 1966 г. Педагогический с 1968г.

 На кафедре РиК с июля 1994 г.

Учебно–методическая работа

Цепенникова Е.П. является высоко квалифицированным преподавателем и выполняла следующие виды учебной работы: читала лекции, вела практические занятия, руководила курсовыми и дипломными работами всех форм обучения. Дипломы, написанные под руководством Цепенниковой Е.П., как правило, получали оценку «отлично».

Ею разработаны и читались 9 учебных дисциплин:

3 дисциплины ГСЭ:

«Мировая и отечественная культура»,  «Мировая и отечественная культура и искусство» «Культурология»,

6 дисциплин ОПД и ДС: «Этнология», «Основы рекламы», «Паблик рилейшнз», «Особенности политической рекламы»,  «Политический маркетинг», «Имиджелогия».

 Цепенникова Е.П. одна из первых на кафедре стала применять компьютер при чтении лекций. Каждый курс имеет электронную версию, прочитан на высоком научно — теоретическом, методологическом и методическом уровне.

Объем выполняемой учебных поручений:

2002/ 2003 уч.г. 1302 часа

2003/2004г.уч.г.  1036ч.

2004/2005 уч.г. 1042 ч.

2005/2006 уч.г. 941ч.

2006/2007уч.г. 1175ч.

2007/2008 уч.г.1186 ч.

2008/2009 уч.г. 842 ч.

2009/2010уч.г.857ч.

По читаемым курсам опубликованы 14 методических пособий,  15 статей  методического характера.

Методическое пособие Цепенниковой Е.П. «Культурология» победило в конкурсе 1997 г. и было опубликовано в АлтГТУ.

Издано фундаментальное методическое пособие по «Этнологии», а так же «Словарь этнологических терминов».

Е.П. Цепенникова автор двух крупных разделов в учебном пособии «Культура России», вышедшем в 2010 г., 2011 гВ 2015 г. ею опубликованы в электронной библиотеке АлтГТУ «Курс лекций» и   «Фонд оценочных средств» по дисциплине «Политический маркетинг«. А также слайды к курсу лекций по дисциплине «Основы рекламы» для направления 031600 Реклама и связи с общественностью.

Она редактировала стандарты нового поколения по всем дисциплинам и добилась того, что кафедра ПЕРВОЙ в университете добилась 100% готовности стандартов. В 2014 году ею проведена актуализация стандартов нового поколения в части списка литературы (в связи с новыми требованиями ОМКО) и фонда оценочных средств. В 2014 году в составе авторского коллектива Андрейчук С.В., Дмитриев В.В., Пашкевич Т.В., Старостенко И.М. участвовала в разработке Основной образовательной программы высшего образования направления 031600 «Реклама и связи с общественностью». 

Осенью 2015 года в составе авторского коллектива  Дмитриев В.В., Пашкевич Т.В. участвовала в разработке Основной образовательной программы высшего образования направления 42.03.01«Реклама и связи с общественностью» заочная форма обучения. 

 В  июле 2015 года Е.П. Цепенникова провела актуализацию 57 стандартов дисциплин направления 031600 «Реклама и связи с общественностью» (включая РУП 12−13) в части «Образовательные технологии.«

В сентябре — ноябре 2015 года  она отредактировала 54 стандарта дисциплин направления 42.03.01 заочная форма обучения,52 стандарта дисциплин направления 42.03.01 очная форма обучения, 34 стандарта дисциплин 032401 вечерней формы обучения.

В феврале — апреле 2016 г. ею актуализированы СТО и СТП по всем формам обучения: специалитет 032401  «Реклама» (вечерняя форма обучения), бакалавриат 42.03.01  (очная и заочная форма обучения) в части дисциплин ОПД и ДС.

В связи с ликвидацией направления «Реклама и связи с общественностью» и специальности «Реклама» в июне — июле 2017 года ею были описаны и переданы  по акту  (на 19 страницах)  руководству  каф. КСОТ  созданные и /или актуализированные ею СТП, СТО, ООП, программы практик, программы ГИА и др. документы, подготовленные ею к аттестации-аккредитации кафедры в  2011 и 2016 гг. —  234 документа общим объёмом 8 558 страниц. 

Научно–исследовательская работа

Область научных интересов – миссионерская деятельность РПЦ на Алтае (1828 -1917 гг). По теме исследования опубликовано 27 статей, сделано 34 доклада на конференциях различного уровня (от международного до кафедрального).

В  августе 2014 года  в соответствии с темой научного исследования и  по поручению ректората провела 6 экскурсий по православным храмам г. Барнаула.

В октябре 2015 года по поручению руководства АлтГТУ провела для ветеранов АлтГТУ  экскурсию по храмам: Знаменского монастыря и Преподобного Серафима Саровского чудотворца.

 25 октября 2017 года  проведена очередная экскурсия по храмам для ветеранов АлтГТУ.

11  октября 2018 года проведена очередная экскурсия по храмам для ветеранов АлтГТУ.

30 октября 2019 года проведена экскурсия по Храму Спиридона Тримифунтского в Санниково. Настоятель отец Анатолий Бочкар.

С 2002 г.  Е.П. Цепенникова  организатор и участник всех  проводимых  в АлтГТУ Администрацией края совместно с Барнаульской епархией Дней славянской культуры на Алтае и Кирилло-Мефодиевских чтений, Рождественских чтений.  За что неоднократно награждалась грамотами Барнаульской епархии и руководства АлтГТУ.  

Награды Е.П. Цепенниковой за сотрудничество с епархией, ныне митрополией:

1. Диплом участника III Краевых Образовательных Чтений секция «Социальные проблемы» директору Центра культуры  Алт ГТУ Цепенниковой Е.П.  за подписью проректора по учебной работе Я.Л. Овчинникова от 17 декабря 2012 года

2. Диплом Цепенниковой   Евгении Павловне,  директору Центра культуры за участие в IV Краевых Рождественских Образовательных Чтениях секции «Ценностные ориентации современной молодёжи», 20 декабря 2013 г. Проректор по учебной работе В.А. Синицын

3. Диплом участника V  Краевых Рождественских Образовательных чтений. Круглый стол «Духовные ценности в современном мире» Цепенниковой Евгении Павловне, директору Центра культуры Алт ГТУ. Проректор по УРЛиА  В.А. Синицын, 10 декабря 2014 года.

4.  Сертификат участника XIII традиционных Кирилло-Мефодиевских образовательных чтений «Славянский мир: письменность и культура», посвященные Дню славянской письменности и культуры, 70-летию Победы в Великой Отечественной войне и Году литературы в России директору Центра культуры Алт ГТУ  Цепенниковой Евгении Павловне от ректора Алт ГТУ А.А. Ситникова 22 мая 2015 г

5.  Диплом Цепенниковой Евгении Павловне за участие в конференции на тему «Современный опыт работы в области утверждения традиционных ценностей как нормы жизни: мнимая опасность или объективная реальность», проводимых в рамках VIКраевых Рождественских Образовательных Чтениях Сибирского федерального округа «Традиции и инновации: культура, общество, личность».  Начальник УКСРиСО  Химочка С.А. от 9−10 декабря 2015 г.

6. Диплом директору Центра культуры АлтГТУ   им. И.И. Ползунова Евгении Павловне Цепенниковой  за участие в  XIV традиционных Кирилло-Мефодиевских чтений, посвящённых  Дню Славянской письменности и культуры  «Духовно-нравственное воспитание обучающейся молодёжи».  Председатель  Оргкомитета  В.В. Дмитриев, 20 мая 2016 г.

7.  Диплом Цепенниковой Евгении Павловне за участие в работе секции «Соработничество Барнаульской и Алтайской Епархии и Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова в деле духовно просветительского воспитания обучающихся и выступление на тему «Почему наружной ркламе Барнаула пришлось застегнуться» (из истории сотрудничества Барнаульской епархии и АлтГТУ им. И.И. Ползунова, проводимой в рамках VII Краевых Рождественских образовательных чтений на тему «1917 -2017: уроки столетия». И.о. ректора А.А. Максименко, 18 ноября 2016 г.

8.  Диплом директору Центра культуры АлтГТУ   Цепенниковой Евгении Павловне за участие в работе научно-практической конференции « Взаимодействие и сотрудничество Барнаульской епархии Алтайской митрополии и АлтГТУ им. И.И. Ползунова в деле воспитания нравственных ценностей обучающихся» и выступление на тему «Соотношение понятий «духовность» и «нравственность», проводимой в рамках VIIIКраевых Рождественских образовательных чтений. Председатель Оргкомитета,  А.М. Марков, 16.11.2017 г.

9. Диплом директору Центра культуры  Алт ГТУ   Цепенниковой Евгении Павловне за участие в  научно-практической конференции « Духовные скрепы современной российской культуры»,  посвящённых Дню славянской письменности и культуры на Алтае. Председатель Оргкомитета,  А.М. Марков, 25.05.2018 г.

10. Благодарность ректора Алт ГТУ  директору ЦК ГФ Алт ГТУ  им. И.И. Ползунова Евгении Павловне Цепенниковой за помощь в организации и проведении научно-практической конференции « Духовные скрепы современной российской культуры»,  посвящённых Дню славянской письменности и культуры на Алтае. Председатель Оргкомитета,  А.М. Марков, 25.05.2018 г.

11. Благодарственное письмо Евгении Павловне Цепенниковой за участие в  IX Рождественских образовательных чтениях «Молодёжь: свобода и ответственность», проводимой Барнаульской епархии по направлению «Церковь и культура». Митрополит Барнаульский и Алтайский Сергий, 2018 г.

12Благодарность ректора Алт ГТУ  директору ЦК ГФ Алт ГТУ  им. И.И. Ползунова Евгении Павловне Цепенниковой  организатору IX Рождественских образовательных « Алт ГТУ им. И.И. Ползунова как площадка профессионального и личностного роста обучающихся» Ректор А.М. Марков, 22.11.2018 г.

13. Диплом Цепенниковой Евгении Павловне  директору Центра культуры Гуманитарного факультета Алт ГТУ им. И.И. Ползунова  участнику Фестиваля культуры в  рамках XVII традиционных Кирилло-Мефодиевских чтений,  посвящённых Дню славянской письменности и культуры. Председатель Оргкомитета Фестиваля культуры,  ректор АлтГТУ А.М. Марков, 29.05.2019 г.

14. Благодарственное письмо Цепенниковой Евгении Павловне  директору  Центра культуры Гуманитарного факультета Алт ГТУ им. И.И. Ползунова  за помощь в организации и проведении Фестиваля культуры в  рамках XVII традиционных Кирилло-Мефодиевских чтений,  посвящённых Дню славянской письменности и культуры. Председатель Оргкомитета Фестиваля культуры,  ректор АлтГТУ А.М. Марков, 29.05.2019 г.

15. Диплом Цепенниковой Евгении Павловне  директору Центра культуры Гуманитарного института Алт ГТУ им. И.И. Ползунова за участие в региональной конференции «Актуальность евразийских идей Александра Невского» в рамках XI Рождественских чтений Председатель Оргкомитета Фестиваля культуры,  ректор АлтГТУ А.М. Марков, 27.11.2020 г.

 Темы её выступлений на чтениях всегда были актуальными: «Роль православного мировоззрения в снятии противоречий современного брака» » Православная цивилизация и глобализация»   «Соотношение духовности и патриотизма на примере Второй мировой войны» «Христианская антропология» » Пасынки второй заповеди» «Аксиология и декалог», «Аксиология и молодёжь современной России», «Тайна отрока Варфоломея», «Проблема свободы выбора: православный аспект», «Пределы власти: православный взгляд», «Понятие «греха» и «социальной нормы», » Посещение Господне. памяти митрофорного протоиерея М.С. Капранова», «Соотношение понятий «духовность» и «нравственность»,  » Духовные наследники Великой победы», » Личность студента: парадигматический и методологический аспекты проблемы», » О сотрудничестве АлтГТУ и барнаульской Митрополии в деле духовно- нравственного  воспитания студентов» » «ЦК ГФ АлтГТУ им.И.И. Ползунова — четверть века духовно-нравственного служения», «Пирамида А. Маслоу или кенозис?» и т.д.

 Список опубликованных научно-методических трудов Цепенниковой Е.П.: (1997 -2018гг)

Транскрибация ИТ-записей — Альянс ПРО

Как мы работаем

Делаем полноценные статьи

Из записи клиента мы делаем полноценную статью. Транскрибаторы работают над содержимым статьи и её оформлением. На выходе получается текст без словесного мусора из устной речи, с заголовками, подзаголовками, списками, таблицами, схемами. В материалы для блога добавляем теги.

Вот фрагмент статьи, которую мы оформили для блога на Хабре:

Переводим английскую запись в русский текст и наоборот

При необходимости мы делаем перевод аудио- и видеозаписей на другой язык. Основные языки, с которыми мы работаем, — русский и английский. Записи транскрибируют профессиональные переводчики из нашего Бюро переводов. Если ваш вебинар на английском языке, а нужна статья на русском, наши транскрибаторы сразу переведут её на нужный язык.

Клиент прислал запись на английском:

Мы написали статью на русском:

Разбираемся в ИТ-тематике

Наши транскрибаторы разбираются в ИТ-тематике. Мы проводим для них обязательную стажировку в нашем бюро ИТ-переводов, после которой они переводят и транскрибируют ИТ- и ИБ-материалы. Они постоянно погружены в тему, поэтому хорошо понимают то, что транскрибируют. Если спикер сказал невнятно service или server, они поймут из контекста, что он имел в виду.

Прошла ИТ-стажировку в Бюро маркетинговых переводов для ИТ-компаний в 2019 году.

Транскрибирует видео- и аудиозаписи клиентов, готовит из них статьи для публикации в блоге, при необходимости переводит статьи на другой язык.

Светлана Чекунова

ИТ/юридический переводчик, редактор, рецензент, транскрибатор

Транскрибаторы – кто это и где найти вакансии удаленно

Транскрибаторы – кто это и чем занимается специалист данной профессии? Такой вопрос задают люди, желающие найти вакансии удаленно для заработка в интернете. Даем простой и конкретный ответ.

Транскрибатор – это человек, который переводит звук в текст. Соответственно, транскрибация – это работа по преобразованию аудио в текстовый формат. Например, какого-нибудь интервью или разговора. Можно транскрибировать и видео, но при условии, что оно сопровождается речевым аудиотреком или сурдопереводом.

Что нужно знать начинающему

Итак, суть транскрибации проста — человек слушает речь на аудио или видео и записывает её в виде текста. Но чтобы начать реально зарабатывать, нужно знать о некоторых важных вещах. Например, о том, с какими сложностями вы можете столкнуться в начале. Да и вообще кому нужна услуга по переводу аудио в текст.

Потребность в таких услугах возникает у организаторов или пользователей вебинаров, желающих иметь информацию в напечатанном виде. Услугой пользуются учащиеся ВУЗов, которым нужен текстовый конспект лекции. Иногда заказывают расшифровку текстов различных собраний или заседаний.

Транскрибация текстов бывает полезна не только для заказчика, но и для исполнителя. Набирая текст, вы получаете новые и полезные знания. Однако приступив к транскрибации, вы столкнётесь и с определёнными трудностями. Надо будет приучить себя к усидчивости. Ведь придётся долго сидеть за клавиатурой, не отвлекаясь ни на что.

Чтобы транскрибирование осуществлялось эффективнее, нужно уметь быстро печатать, а лучше владеть слепым методом печати. Но владеть набором текстов недостаточно. Важно уметь еще и слушать. Дело в том, что речь человека изобилует мусорными словами, словами-паразитами, междометиями. Обычно при исполнении заказа требуется избавляться от лишних слов и приводить речь в удобно читаемый, красивый текст. Не у каждого хватит на это терпения.

Из оборудования вам будут нужны компьютер и наушники или колонки. Из программного обеспечения могут потребоваться аудио и видео редакторы, текстовый редактор. Мастер транскрибации как правило использует в своей работе программы, изменяющие темп прослушиваемой записи. Это позволяет замедлять расшифровываемую речь, когда она невнятна. А также ускорять запись, когда аудиозапись и речь высокого качества.

Несмотря на наличие возможности транскрибировать речь с помощью программ автоматического распознавания, потребность в человеке в этом виде работ будет оставаться актуальной многие годы. Программы пока не достигли такого уровня, чтобы результаты удовлетворяли всех потребителей.

Плюсы и минусы работы транскрибатора

Прежде чем начать работать, нужно знать основные достоинства и недостатки этой работы.

Плюсы

  • Свободный график работы, возможность зарабатывать в удобное время суток.
  • Отсутствие начальства и сотрудников, от которых вы будете зависеть.
  • Отсутствие издержек, связанных с соблюдением дресс-кода, обедов на работе, необходимостью ежедневно добираться до места работы.
  • Получение новой информации, способствующей интеллектуальному развитию.

Минусы

  • Нерегулярность появления заказов на транскрибацию. Часто вы будете тратить время в поиске заказов, а иногда вам придётся сильно напрягаться, чтобы исполнить своевременно срочный заказ.
  • Монотонность работы, требующая непрерывно повторять одни и те же действия, что может приводить к утомлению и моральной усталости.

Где найти вакансии удаленно

Понимая, что такое транскрибация текста и каковы особенности этой работы, возникает следующий вопрос. Где можно найти заказы на транскрибацию?

Их лучше всего искать на биржах фриланса с хорошей репутацией. Вот некоторые из них:

Где еще искать заказы?

Конечно, представленный перечень – далеко не полный список сайтов, где транскрибаторы могут получить заказы. Воспользовавшись поисковиком, вы найдёте таких же ресурсов больше. Но мы советуем использовать только те, которые работают многие годы уже и хорошо себя зарекомендовали. Лучше регистрироваться сразу на нескольких. Это повысит ваши шансы находить заказы.

Еще один способ поиска клиентов – создание групп в соцсетях. Создав группу, вы распространяете объявления напрямую потенциальным заказчикам. Таким образом вы облегчаете потенциальному работодателю поиск исполнителя. А еще транскрибация текста может быть нужна работодателям, публикующим объявления на онлайновых биржах труда. Иногда здесь появляется возможность найти постоянных заказчиков.

Транскрибаторы – кто это с точки зрения работодателей

С позиции работодателей траскрибаторы – это люди, которые готовы выполнить определенные виды работ. Знание их помогает искать заказы. Основные типы заказов на транскрибацию: семинары, тренинги, вебинары, телефонные разговоры, лекции, телепередачи, интервью, подкасты.

Важное предупреждение! Интернет наполнен всевозможными мошенниками, наживающимися на желающих найти работу. Поэтому при поиске вакансий не вносите нигде ни за что какую-нибудь плату. Исключением может являться только плата на проверенных ресурсах-биржах, которые могут взимать небольшие суммы за дополнительные услуги. Но и здесь найти работу всегда можно без внесения какой-либо предоплаты. Биржи зарабатывают деньги, получая небольшую комиссию с оплаты уже выполненных работ.

Что влияет на уровень заработка

Расценивается такая работа обычно поминутно. На стоимость работ транскрибатора влияют следующие параметры:

  • Требуемые заказчиками сроки исполнения.
  • Засоренность аудиодорожки шумами, музыкой и другими звуками.
  • Сложность восприятия самой речи.
  • Наличие специальной терминологии в записи.
  • Наличие иностранной речи в записи.
  • Особые требования к редактированию результата.

Согласно информации опытных фрилансеров, основная проблема в этот виде получения дохода в интернете — поиск заказчиков. Появляющиеся на биржах заказы довольно быстро разбираются исполнителями. Для увеличения количества заказов, вам придётся нарабатывать свой рейтинг на биржах фриланса, зарекомендовать себя как ответственного исполнителя, быстро и качественно, выполняющего работу.

Можно выделить главные направления усилий в увеличении доходов на транскрибации.

  • Расширение количества ресурсов для поиска работы;
  • Увеличение скорости набора текстов;
  • Применение специализированных программ, с возможностью распознавания речи;
  • Освоение иностранных языков — к примеру, заказов на английском языке больше, чем на русском, и они оплачиваются дороже.

Инструменты транскрибатора

Выполнив несколько заказов на транскрибацию, вы поймёте, что прослушивать записи стандартными проигрывателями неудобно. Приходится отматывать запись вперёд или назад, а делать это с помощью клавиатуры или мыши утомляет. Существуют специальные проигрыватели, настроенные для данного вида работ. В них можно замедлять воспроизведение, настраивать горячие клавиши для перемотки. Применение таких программ позволит вам сократить время на транскрибацию.

Популярностью пользуются такие программы как:

  • Express Scribe – редактор текстов со встроенным аудиопроигрывателем, позволяющим менять скорость прослушивания.
  • Transcriber-pro — отличается от предыдущей программы возможностью воспроизведения видеофайлов.
  • LossPlay — программа воспроизведения аудиозаписей с изменением скорости. Интегрируется с текстовым редактором;
  • VOCO — имеет возможность автоматического распознавания голоса.
  • Speechpad – преобразует речь в текстовый формат.
  • Dictationio – диктофон, распознающий вашу речь, удобен тем, что вы можете просто диктовать прослушиваемую речь, заново не печатая.

Конечно, после автоматического распознавания речи  необходимо редактировать текст. Подобные программы облегчают работу, но не делают её за вас. Иначе заказчики и не обращались бы к помощи транскрибаторов.

В заключение отметим, что транскрибация – доступный метод удалённого заработка в интернете для грамотных, трудолюбивых и целеустремлённых людей.

Узнав, чем занимаются транскрибаторы, кто это и другие детали, можно приступить к делу. Заработок на транскрибации доступен многим. Ведь для нахождения заказов и их выполнения не требуется нести финансовые издержки. Навыки совершенствуются в процессе работы. Но помните, что уровень вашего дохода во многом зависит от вас.

перевод, произношение, транскрипция, примеры использования

Ты должен учиться справляться со своим характером. 

Он никогда не мог справиться с математикой. 

Каков хозяин, таков и слуга. / Каков поп, таков и приход. (посл.) 

Он научился контролировать свой страх высоты. 

I never quite mastered the art of walking in high heels. 

Я так и не смогла полностью овладеть умением ходить на высоких каблуках. 

She mastered French in college. 

В университете она в совершенстве овладела французским языком. 

We work for a hard master. 

Мы работаем на требовательного хозяина. 

He is a master of disguise. 

Он мастер перевоплощения. 

Whether we like him or lump him, he is master of the situation. 

Нравится он нам или нет, он всё равно хозяин положения. 

She is a master of her craft. 

Она — мастер своего дела. 

The dog saved its master’s life. 

Собака спасла жизнь своему хозяину. 

She’s a master of deadpan. 

Она королева невозмутимости. (дословно: мастер невозмутимости. значение: она совершенно невозмутима / очень серьёзна) 

She’s a master at manipulating people. 

Она мастерски манипулирует людьми. 

English grammar can be hard to master. 

Английская грамматика порой даётся нелегко. 

She apprenticed with the great master. 

Она училась у большого мастера. 

Master believes all the crams we tell. 

Хозяин верит любой чуши, которую мы ему рассказываем. 

We’ve lost the master disk. 

Мы потеряли мастер-диск /оригинал диска/. 

He is a master of diplomacy. 

Он хороший дипломат. 

He served his master devotedly 

Он преданно служил своему хозяину. 

He was a stern yet fair master. 

Он был строгим, но справедливым хозяином. 

He’s a master of the business deal. 

Он является мастером сделки. 

She apprenticed with the great master 

Она была ученицей у этого великого мастера. 

How’s young Master Toby today? 

Как сегодня поживает молодой господин Тоби? 

A master coup, which decides the game. 

Мастерский ход, решивший исход игры. 

The sword was made by a master armorer. 

Меч был изготовлен старшим мастером-оружейником. 

Runyon was a master of the short story. 

Дэймон Раньон был мастером короткого рассказа. 

She holds a Master’s degree from Harvard. 

Она имеет степень магистра Гарварда. 

Основные факторы транскрипции и медиатор создают суперэнхансеры в ключевых генах идентификации клеток

Резюме

Основные факторы транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog связывают элементы энхансера и привлекают медиатор для активации большей части программы экспрессии генов плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ESC) . Мы сообщаем здесь, что основные факторы транскрипции ESC образуют необычные энхансерные домены в большинстве генов, которые контролируют плюрипотентное состояние. Эти домены, которые мы называем суперэнхансерами, состоят из кластеров энхансеров, которые плотно заняты главными регуляторами и медиатором.Супер-энхансеры отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям. Пониженные уровни Oct4 или Mediator вызывают преимущественную потерю экспрессии генов, ассоциированных с суперэнхансерами, по сравнению с другими генами, предполагая, как изменения в программах экспрессии генов могут осуществляться во время развития. В других более дифференцированных клетках суперинхансеры, содержащие основные факторы транскрипции, специфичные для определенного типа клеток, также обнаруживаются в генах, которые определяют идентичность клеток.Таким образом, суперэнхансеры играют ключевую роль в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Введение

Факторы транскрипции обычно регулируют экспрессию генов путем связывания цис-действующих регуляторных элементов, известных как энхансеры, и привлечения коактиваторов и РНК-полимеразы II (RNA Pol II) к генам-мишеням (Lelli et al., 2012; Ong and Corces, 2011) . Энхансеры — это сегменты ДНК, которые обычно составляют несколько сотен пар оснований в длину и обычно заняты множеством факторов транскрипции (Carey, 1998; Levine and Tjian, 2003; Panne, 2008; Spitz and Furlong, 2012).

Большая часть транскрипционного контроля развития млекопитающих обусловлена ​​разнообразной активностью энхансеров, связанных с факторами транскрипции, которые контролируют специфичные для клеточного типа паттерны экспрессии генов (Bulger and Groudine, 2011; Hawrylycz et al., 2012; Maston et al. , 2006). В геноме млекопитающих было идентифицировано от 400000 до 1,4 миллиона предполагаемых энхансеров с помощью различных высокопроизводительных методов, которые выявляют особенности энхансеров, такие как специфические модификации гистонов (Bernstein et al., 2012; Турман и др., 2012). Количество энхансеров, которые активны в любом одном типе клеток, оценивается в десятки тысяч, а активность энхансеров в значительной степени зависит от типа клеток (Bernstein et al., 2012; Heintzman et al., 2009; Shen et al. , 2012; Visel et al., 2009; Yip et al., 2012).

В эмбриональных стволовых клетках (ESC) контроль над программой экспрессии генов, которая устанавливает и поддерживает состояние ESC, зависит от удивительно небольшого числа основных факторов транскрипции (Ng and Surani, 2011; Orkin and Hochedlinger, 2011; Young, 2011) .Эти факторы транскрипции, которые включают Oct4, Sox2 и Nanog, связываются с энхансерами вместе с коактиваторным комплексом Mediator (Kagey et al., 2010). Комплекс Mediator облегчает способность связанных с энхансером факторов транскрипции рекрутировать РНК Pol II на промоторы генов-мишеней (Borggrefe and Yue, 2011; Conaway and Conaway, 2011; Kornberg, 2005; Malik and Roeder, 2010) и необходим для поддержание состояния ESC и эмбрионального развития (Ito et al., 2000; Kagey et al., 2010; Risley et al., 2010).

ESC очень чувствительны к пониженным уровням медиатора. В самом деле, снижение уровней многих субъединиц Mediator вызывает такую ​​же быструю потерю экспрессии ESC-специфических генов, что и потеря Oct4 и других основных факторов транскрипции (Kagey et al., 2010). Неясно, почему пониженные уровни Mediator, общего коактиватора, могут фенокопировать эффекты пониженных уровней Oct4 в ESC.

Интерес к дальнейшему пониманию важности медиатора в ESCs привел нас к дальнейшим исследованиям энхансеров, связанных с основными факторами транскрипции и медиатором в этих клетках.Мы обнаружили, что большая часть связанного с энхансером медиатора занимает исключительно большие энхансерные домены и что эти домены связаны с генами, которые играют важную роль в биологии ESC. Было обнаружено, что эти большие домены или суперэнхансеры содержат высокие уровни ключевых факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, чтобы стимулировать более высокую транскрипционную активность, чем типичные энхансеры, и были исключительно чувствительны к пониженным уровням медиатора. . Суперэнхансеры были обнаружены в большом количестве дифференцированных типов клеток, опять же связанных с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в контроле их программы экспрессии генов.Эти результаты показывают, что суперэнхансеры управляют генами, необходимыми для идентификации клеток многих типов клеток млекопитающих.

Результаты

Большие геномные домены, занятые главными факторами транскрипции и медиатором в ESC

Предыдущие исследования показали, что совместная занятость геномных сайтов ESC факторами транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog в высокой степени предсказывает активность энхансера (Chen et al. ., 2008), и этот посредник обычно ассоциируется с этими сайтами (Kagey et al., 2010).Мы создали высококачественные наборы данных ChIP-Seq для Oct4, Sox2 и Nanog (OSN) в мышиных ESC и идентифицировали 8 794 сайта, которые совместно заняты этими тремя факторами транскрипции, чтобы аннотировать энхансеры в ESC (таблица S1, данные S1). Изучение энхансеров в нескольких генах, играющих важную роль в биологии ESC, выявило необычную особенность: большой домен, содержащий кластеры составляющих энхансеров (). В то время как подавляющее большинство энхансеров охватывает сегменты ДНК размером в несколько сотен пар оснований (), некоторые части генома содержат кластеры энхансеров размером до 50 килобайт ().Мы обнаружили, что энхансеры ESC можно разделить на два класса в зависимости от уровней медиатора: один класс включает подавляющее большинство энхансеров, а другой — 231 большой домен энхансера (). Примерно 40% сигнала медиатора, связанного с энхансерами, было обнаружено в этих 231 энхансерных доменах. Ключевые особенности 231 домена, содержащего высокие уровни медиатора, которые мы называем суперэнхансерами, заключаются в следующем: 1) они охватывают участки ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и 2) они имеют уровни медиатора, которые являются по крайней мере, на порядок больше, чем у типичного энхансера ().

Энхансеры и суперэнхансеры в ESC

A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах

Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 −4 , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 −34 , Esrrb = 10 −25 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 -45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 -4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 -34 и 10 -25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 −45 ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры связаны с ключевыми генами плюрипотентности ESC.

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 -2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 -2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 -5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

Суперэнхансеры придают высокую транскрипционную активность и чувствительность к возмущениям

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −5 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 −5 , день 4 = 10 −8 , день 5 = ​​10 −10 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 −11 , день 4 = 10 −11 , день 5 = ​​10 −13 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 −5 , 10 −8 и 10 −10 соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 −11 , 10 −11 и 10 — 13 соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

Супер-энхансеры в про-B-клетках

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 −5 , E2A = 10 −22 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −6 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 −22 ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 -6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

Суперэнхансеры обычно связаны с ключевыми генами идентификации клеток

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

Минимальный промотор Oct4 амплифицировали из геномной ДНК мыши и клонировали в сайты XhoI и HindIII основного вектора pGL3 (Promega). Затем фрагменты энхансера клонировали в сайты BamHI и SalI вектора pGL3-pOct4. ЭСК мыши v6.5 трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Плазмиду pRL-SV40 (Promega) котрансфицировали в качестве контроля для нормализации. Клетки инкубировали в течение 24 часов и активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (Promega).Геномные координаты клонированных фрагментов приведены в таблице S7.

Анализ данных

Все наборы данных ChIP-Seq были выровнены с использованием Bowtie (версия 0.12.2) (Langmead et al., 2009) для построения версии MM9 генома мыши или HG18 генома человека. Идентификатор доступа GEO для выровненных и необработанных данных: {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE44288», «term_id»: «44288»}} GSE44288 (www.ncbi.nlm .nih.gov / geo /). Наборы данных, использованные в этой рукописи, можно найти в Таблице S8.

Мы разработали простой метод для расчета нормализованной плотности чтения набора данных ChIP-Seq в любом регионе.Считывания ChIP-Seq, выравнивающиеся по области, были увеличены на 200 пар оснований, и была рассчитана плотность считываний на пару оснований (bp). Плотность считываний в каждой области была нормализована к общему количеству миллионов отображенных считываний, дающих плотность считывания в единицах считываний на миллион сопоставленных считываний на пару оснований (об / мин / пар оснований)

Мы использовали MACS версии 1.4.1 (анализ на основе модели ChIP-Seq) (Zhang et al., 2008) алгоритм поиска пиков для выявления областей обогащения ChIP-Seq на фоне. Для всех наборов данных использовалось пороговое значение p для обогащения 10 −9 .

Энхансеры были определены как области обогащения ChIP-Seq для фактора (ов) транскрипции. Чтобы точно захватить плотные кластеры энхансеров, мы позволили сшить области в пределах 12,5 КБ друг от друга.

Методы идентификации и характеристики суперэнхансеров, а также отнесение энхансеров к генам полностью описаны в расширенных экспериментальных процедурах.

Основные факторы транскрипции и медиатор создают суперэнхансеры в ключевых генах идентификации клеток

Резюме

Основные факторы транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog связывают элементы энхансера и привлекают медиатор для активации большей части программы экспрессии генов плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ESCs). ).Мы сообщаем здесь, что основные факторы транскрипции ESC образуют необычные энхансерные домены в большинстве генов, которые контролируют плюрипотентное состояние. Эти домены, которые мы называем суперэнхансерами, состоят из кластеров энхансеров, которые плотно заняты главными регуляторами и медиатором. Супер-энхансеры отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям. Пониженные уровни Oct4 или Mediator вызывают преимущественную потерю экспрессии генов, ассоциированных с суперэнхансерами, по сравнению с другими генами, предполагая, как изменения в программах экспрессии генов могут осуществляться во время развития.В других более дифференцированных клетках суперинхансеры, содержащие основные факторы транскрипции, специфичные для определенного типа клеток, также обнаруживаются в генах, которые определяют идентичность клеток. Таким образом, суперэнхансеры играют ключевую роль в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Введение

Факторы транскрипции обычно регулируют экспрессию генов путем связывания цис-действующих регуляторных элементов, известных как энхансеры, и привлечения коактиваторов и РНК-полимеразы II (RNA Pol II) к генам-мишеням (Lelli et al., 2012; Ong and Corces, 2011) .Энхансеры — это сегменты ДНК, которые обычно составляют несколько сотен пар оснований в длину и обычно заняты множеством факторов транскрипции (Carey, 1998; Levine and Tjian, 2003; Panne, 2008; Spitz and Furlong, 2012).

Большая часть транскрипционного контроля развития млекопитающих обусловлена ​​разнообразной активностью энхансеров, связанных с факторами транскрипции, которые контролируют специфичные для клеточного типа паттерны экспрессии генов (Bulger and Groudine, 2011; Hawrylycz et al., 2012; Maston et al. , 2006).В геноме млекопитающих было идентифицировано от 400000 до 1,4 миллиона предполагаемых энхансеров с помощью различных высокопроизводительных методов, которые выявляют особенности энхансеров, такие как специфические модификации гистонов (Bernstein et al., 2012; Thurman et al., 2012). Количество энхансеров, которые активны в любом одном типе клеток, оценивается в десятки тысяч, а активность энхансеров в значительной степени зависит от типа клеток (Bernstein et al., 2012; Heintzman et al., 2009; Shen et al. , 2012; Visel et al., 2009; Ип и др., 2012).

В эмбриональных стволовых клетках (ESC) контроль над программой экспрессии генов, которая устанавливает и поддерживает состояние ESC, зависит от удивительно небольшого числа основных факторов транскрипции (Ng and Surani, 2011; Orkin and Hochedlinger, 2011; Young, 2011) . Эти факторы транскрипции, которые включают Oct4, Sox2 и Nanog, связываются с энхансерами вместе с коактиваторным комплексом Mediator (Kagey et al., 2010). Комплекс Mediator облегчает способность связанных с энхансером факторов транскрипции рекрутировать РНК Pol II на промоторы генов-мишеней (Borggrefe and Yue, 2011; Conaway and Conaway, 2011; Kornberg, 2005; Malik and Roeder, 2010) и необходим для поддержание состояния ESC и эмбрионального развития (Ito et al., 2000; Kagey et al., 2010; Рисли и др., 2010).

ESC очень чувствительны к пониженным уровням медиатора. В самом деле, снижение уровней многих субъединиц Mediator вызывает такую ​​же быструю потерю экспрессии ESC-специфических генов, что и потеря Oct4 и других основных факторов транскрипции (Kagey et al., 2010). Неясно, почему пониженные уровни Mediator, общего коактиватора, могут фенокопировать эффекты пониженных уровней Oct4 в ESC.

Интерес к дальнейшему пониманию важности медиатора в ESCs привел нас к дальнейшим исследованиям энхансеров, связанных с основными факторами транскрипции и медиатором в этих клетках.Мы обнаружили, что большая часть связанного с энхансером медиатора занимает исключительно большие энхансерные домены и что эти домены связаны с генами, которые играют важную роль в биологии ESC. Было обнаружено, что эти большие домены или суперэнхансеры содержат высокие уровни ключевых факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, чтобы стимулировать более высокую транскрипционную активность, чем типичные энхансеры, и были исключительно чувствительны к пониженным уровням медиатора. . Суперэнхансеры были обнаружены в большом количестве дифференцированных типов клеток, опять же связанных с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в контроле их программы экспрессии генов.Эти результаты показывают, что суперэнхансеры управляют генами, необходимыми для идентификации клеток многих типов клеток млекопитающих.

Результаты

Большие геномные домены, занятые главными факторами транскрипции и медиатором в ESC

Предыдущие исследования показали, что совместная занятость геномных сайтов ESC факторами транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog в высокой степени предсказывает активность энхансера (Chen et al. ., 2008), и этот посредник обычно ассоциируется с этими сайтами (Kagey et al., 2010).Мы создали высококачественные наборы данных ChIP-Seq для Oct4, Sox2 и Nanog (OSN) в мышиных ESC и идентифицировали 8 794 сайта, которые совместно заняты этими тремя факторами транскрипции, чтобы аннотировать энхансеры в ESC (таблица S1, данные S1). Изучение энхансеров в нескольких генах, играющих важную роль в биологии ESC, выявило необычную особенность: большой домен, содержащий кластеры составляющих энхансеров (). В то время как подавляющее большинство энхансеров охватывает сегменты ДНК размером в несколько сотен пар оснований (), некоторые части генома содержат кластеры энхансеров размером до 50 килобайт ().Мы обнаружили, что энхансеры ESC можно разделить на два класса в зависимости от уровней медиатора: один класс включает подавляющее большинство энхансеров, а другой — 231 большой домен энхансера (). Примерно 40% сигнала медиатора, связанного с энхансерами, было обнаружено в этих 231 энхансерных доменах. Ключевые особенности 231 домена, содержащего высокие уровни медиатора, которые мы называем суперэнхансерами, заключаются в следующем: 1) они охватывают участки ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и 2) они имеют уровни медиатора, которые являются по крайней мере, на порядок больше, чем у типичного энхансера ().

Энхансеры и суперэнхансеры в ESC

A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 −4 , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 −34 , Esrrb = 10 −25 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 -45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 -4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 -34 и 10 -25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 −45 ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры связаны с ключевыми генами плюрипотентности ESC.

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 -2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 -2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 -5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

Суперэнхансеры придают высокую транскрипционную активность и чувствительность к возмущениям

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −5 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 −5 , день 4 = 10 −8 , день 5 = ​​10 −10 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 −11 , день 4 = 10 −11 , день 5 = ​​10 −13 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 −5 , 10 −8 и 10 −10 соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 −11 , 10 −11 и 10 — 13 соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

Супер-энхансеры в про-B-клетках

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 −5 , E2A = 10 −22 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −6 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 −22 ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 -6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

Суперэнхансеры обычно связаны с ключевыми генами идентификации клеток

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

Минимальный промотор Oct4 амплифицировали из геномной ДНК мыши и клонировали в сайты XhoI и HindIII основного вектора pGL3 (Promega). Затем фрагменты энхансера клонировали в сайты BamHI и SalI вектора pGL3-pOct4. ЭСК мыши v6.5 трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Плазмиду pRL-SV40 (Promega) котрансфицировали в качестве контроля для нормализации. Клетки инкубировали в течение 24 часов и активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (Promega).Геномные координаты клонированных фрагментов приведены в таблице S7.

Анализ данных

Все наборы данных ChIP-Seq были выровнены с использованием Bowtie (версия 0.12.2) (Langmead et al., 2009) для построения версии MM9 генома мыши или HG18 генома человека. Идентификатор доступа GEO для выровненных и необработанных данных: {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE44288», «term_id»: «44288»}} GSE44288 (www.ncbi.nlm .nih.gov / geo /). Наборы данных, использованные в этой рукописи, можно найти в Таблице S8.

Мы разработали простой метод для расчета нормализованной плотности чтения набора данных ChIP-Seq в любом регионе.Считывания ChIP-Seq, выравнивающиеся по области, были увеличены на 200 пар оснований, и была рассчитана плотность считываний на пару оснований (bp). Плотность считываний в каждой области была нормализована к общему количеству миллионов отображенных считываний, дающих плотность считывания в единицах считываний на миллион сопоставленных считываний на пару оснований (об / мин / пар оснований)

Мы использовали MACS версии 1.4.1 (анализ на основе модели ChIP-Seq) (Zhang et al., 2008) алгоритм поиска пиков для выявления областей обогащения ChIP-Seq на фоне. Для всех наборов данных использовалось пороговое значение p для обогащения 10 −9 .

Энхансеры были определены как области обогащения ChIP-Seq для фактора (ов) транскрипции. Чтобы точно захватить плотные кластеры энхансеров, мы позволили сшить области в пределах 12,5 КБ друг от друга.

Методы идентификации и характеристики суперэнхансеров, а также отнесение энхансеров к генам полностью описаны в расширенных экспериментальных процедурах.

Основные факторы транскрипции и медиатор создают суперэнхансеры в ключевых генах идентификации клеток

Резюме

Основные факторы транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog связывают элементы энхансера и привлекают медиатор для активации большей части программы экспрессии генов плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ESCs). ).Мы сообщаем здесь, что основные факторы транскрипции ESC образуют необычные энхансерные домены в большинстве генов, которые контролируют плюрипотентное состояние. Эти домены, которые мы называем суперэнхансерами, состоят из кластеров энхансеров, которые плотно заняты главными регуляторами и медиатором. Супер-энхансеры отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям. Пониженные уровни Oct4 или Mediator вызывают преимущественную потерю экспрессии генов, ассоциированных с суперэнхансерами, по сравнению с другими генами, предполагая, как изменения в программах экспрессии генов могут осуществляться во время развития.В других более дифференцированных клетках суперинхансеры, содержащие основные факторы транскрипции, специфичные для определенного типа клеток, также обнаруживаются в генах, которые определяют идентичность клеток. Таким образом, суперэнхансеры играют ключевую роль в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Введение

Факторы транскрипции обычно регулируют экспрессию генов путем связывания цис-действующих регуляторных элементов, известных как энхансеры, и привлечения коактиваторов и РНК-полимеразы II (RNA Pol II) к генам-мишеням (Lelli et al., 2012; Ong and Corces, 2011) .Энхансеры — это сегменты ДНК, которые обычно составляют несколько сотен пар оснований в длину и обычно заняты множеством факторов транскрипции (Carey, 1998; Levine and Tjian, 2003; Panne, 2008; Spitz and Furlong, 2012).

Большая часть транскрипционного контроля развития млекопитающих обусловлена ​​разнообразной активностью энхансеров, связанных с факторами транскрипции, которые контролируют специфичные для клеточного типа паттерны экспрессии генов (Bulger and Groudine, 2011; Hawrylycz et al., 2012; Maston et al. , 2006).В геноме млекопитающих было идентифицировано от 400000 до 1,4 миллиона предполагаемых энхансеров с помощью различных высокопроизводительных методов, которые выявляют особенности энхансеров, такие как специфические модификации гистонов (Bernstein et al., 2012; Thurman et al., 2012). Количество энхансеров, которые активны в любом одном типе клеток, оценивается в десятки тысяч, а активность энхансеров в значительной степени зависит от типа клеток (Bernstein et al., 2012; Heintzman et al., 2009; Shen et al. , 2012; Visel et al., 2009; Ип и др., 2012).

В эмбриональных стволовых клетках (ESC) контроль над программой экспрессии генов, которая устанавливает и поддерживает состояние ESC, зависит от удивительно небольшого числа основных факторов транскрипции (Ng and Surani, 2011; Orkin and Hochedlinger, 2011; Young, 2011) . Эти факторы транскрипции, которые включают Oct4, Sox2 и Nanog, связываются с энхансерами вместе с коактиваторным комплексом Mediator (Kagey et al., 2010). Комплекс Mediator облегчает способность связанных с энхансером факторов транскрипции рекрутировать РНК Pol II на промоторы генов-мишеней (Borggrefe and Yue, 2011; Conaway and Conaway, 2011; Kornberg, 2005; Malik and Roeder, 2010) и необходим для поддержание состояния ESC и эмбрионального развития (Ito et al., 2000; Kagey et al., 2010; Рисли и др., 2010).

ESC очень чувствительны к пониженным уровням медиатора. В самом деле, снижение уровней многих субъединиц Mediator вызывает такую ​​же быструю потерю экспрессии ESC-специфических генов, что и потеря Oct4 и других основных факторов транскрипции (Kagey et al., 2010). Неясно, почему пониженные уровни Mediator, общего коактиватора, могут фенокопировать эффекты пониженных уровней Oct4 в ESC.

Интерес к дальнейшему пониманию важности медиатора в ESCs привел нас к дальнейшим исследованиям энхансеров, связанных с основными факторами транскрипции и медиатором в этих клетках.Мы обнаружили, что большая часть связанного с энхансером медиатора занимает исключительно большие энхансерные домены и что эти домены связаны с генами, которые играют важную роль в биологии ESC. Было обнаружено, что эти большие домены или суперэнхансеры содержат высокие уровни ключевых факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, чтобы стимулировать более высокую транскрипционную активность, чем типичные энхансеры, и были исключительно чувствительны к пониженным уровням медиатора. . Суперэнхансеры были обнаружены в большом количестве дифференцированных типов клеток, опять же связанных с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в контроле их программы экспрессии генов.Эти результаты показывают, что суперэнхансеры управляют генами, необходимыми для идентификации клеток многих типов клеток млекопитающих.

Результаты

Большие геномные домены, занятые главными факторами транскрипции и медиатором в ESC

Предыдущие исследования показали, что совместная занятость геномных сайтов ESC факторами транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog в высокой степени предсказывает активность энхансера (Chen et al. ., 2008), и этот посредник обычно ассоциируется с этими сайтами (Kagey et al., 2010).Мы создали высококачественные наборы данных ChIP-Seq для Oct4, Sox2 и Nanog (OSN) в мышиных ESC и идентифицировали 8 794 сайта, которые совместно заняты этими тремя факторами транскрипции, чтобы аннотировать энхансеры в ESC (таблица S1, данные S1). Изучение энхансеров в нескольких генах, играющих важную роль в биологии ESC, выявило необычную особенность: большой домен, содержащий кластеры составляющих энхансеров (). В то время как подавляющее большинство энхансеров охватывает сегменты ДНК размером в несколько сотен пар оснований (), некоторые части генома содержат кластеры энхансеров размером до 50 килобайт ().Мы обнаружили, что энхансеры ESC можно разделить на два класса в зависимости от уровней медиатора: один класс включает подавляющее большинство энхансеров, а другой — 231 большой домен энхансера (). Примерно 40% сигнала медиатора, связанного с энхансерами, было обнаружено в этих 231 энхансерных доменах. Ключевые особенности 231 домена, содержащего высокие уровни медиатора, которые мы называем суперэнхансерами, заключаются в следующем: 1) они охватывают участки ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и 2) они имеют уровни медиатора, которые являются по крайней мере, на порядок больше, чем у типичного энхансера ().

Энхансеры и суперэнхансеры в ESC

A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 −4 , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 −34 , Esrrb = 10 −25 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 -45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 -4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 -34 и 10 -25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 −45 ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры связаны с ключевыми генами плюрипотентности ESC.

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 -2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 -2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 -5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

Суперэнхансеры придают высокую транскрипционную активность и чувствительность к возмущениям

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −5 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 −5 , день 4 = 10 −8 , день 5 = ​​10 −10 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 −11 , день 4 = 10 −11 , день 5 = ​​10 −13 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 −5 , 10 −8 и 10 −10 соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 −11 , 10 −11 и 10 — 13 соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

Супер-энхансеры в про-B-клетках

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 −5 , E2A = 10 −22 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −6 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 −22 ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 -6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

Суперэнхансеры обычно связаны с ключевыми генами идентификации клеток

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

Минимальный промотор Oct4 амплифицировали из геномной ДНК мыши и клонировали в сайты XhoI и HindIII основного вектора pGL3 (Promega). Затем фрагменты энхансера клонировали в сайты BamHI и SalI вектора pGL3-pOct4. ЭСК мыши v6.5 трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Плазмиду pRL-SV40 (Promega) котрансфицировали в качестве контроля для нормализации. Клетки инкубировали в течение 24 часов и активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (Promega).Геномные координаты клонированных фрагментов приведены в таблице S7.

Анализ данных

Все наборы данных ChIP-Seq были выровнены с использованием Bowtie (версия 0.12.2) (Langmead et al., 2009) для построения версии MM9 генома мыши или HG18 генома человека. Идентификатор доступа GEO для выровненных и необработанных данных: {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE44288», «term_id»: «44288»}} GSE44288 (www.ncbi.nlm .nih.gov / geo /). Наборы данных, использованные в этой рукописи, можно найти в Таблице S8.

Мы разработали простой метод для расчета нормализованной плотности чтения набора данных ChIP-Seq в любом регионе.Считывания ChIP-Seq, выравнивающиеся по области, были увеличены на 200 пар оснований, и была рассчитана плотность считываний на пару оснований (bp). Плотность считываний в каждой области была нормализована к общему количеству миллионов отображенных считываний, дающих плотность считывания в единицах считываний на миллион сопоставленных считываний на пару оснований (об / мин / пар оснований)

Мы использовали MACS версии 1.4.1 (анализ на основе модели ChIP-Seq) (Zhang et al., 2008) алгоритм поиска пиков для выявления областей обогащения ChIP-Seq на фоне. Для всех наборов данных использовалось пороговое значение p для обогащения 10 −9 .

Энхансеры были определены как области обогащения ChIP-Seq для фактора (ов) транскрипции. Чтобы точно захватить плотные кластеры энхансеров, мы позволили сшить области в пределах 12,5 КБ друг от друга.

Методы идентификации и характеристики суперэнхансеров, а также отнесение энхансеров к генам полностью описаны в расширенных экспериментальных процедурах.

Основные факторы транскрипции и медиатор создают суперэнхансеры в ключевых генах идентификации клеток

Резюме

Основные факторы транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog связывают элементы энхансера и привлекают медиатор для активации большей части программы экспрессии генов плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ESCs). ).Мы сообщаем здесь, что основные факторы транскрипции ESC образуют необычные энхансерные домены в большинстве генов, которые контролируют плюрипотентное состояние. Эти домены, которые мы называем суперэнхансерами, состоят из кластеров энхансеров, которые плотно заняты главными регуляторами и медиатором. Супер-энхансеры отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям. Пониженные уровни Oct4 или Mediator вызывают преимущественную потерю экспрессии генов, ассоциированных с суперэнхансерами, по сравнению с другими генами, предполагая, как изменения в программах экспрессии генов могут осуществляться во время развития.В других более дифференцированных клетках суперинхансеры, содержащие основные факторы транскрипции, специфичные для определенного типа клеток, также обнаруживаются в генах, которые определяют идентичность клеток. Таким образом, суперэнхансеры играют ключевую роль в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Введение

Факторы транскрипции обычно регулируют экспрессию генов путем связывания цис-действующих регуляторных элементов, известных как энхансеры, и привлечения коактиваторов и РНК-полимеразы II (RNA Pol II) к генам-мишеням (Lelli et al., 2012; Ong and Corces, 2011) .Энхансеры — это сегменты ДНК, которые обычно составляют несколько сотен пар оснований в длину и обычно заняты множеством факторов транскрипции (Carey, 1998; Levine and Tjian, 2003; Panne, 2008; Spitz and Furlong, 2012).

Большая часть транскрипционного контроля развития млекопитающих обусловлена ​​разнообразной активностью энхансеров, связанных с факторами транскрипции, которые контролируют специфичные для клеточного типа паттерны экспрессии генов (Bulger and Groudine, 2011; Hawrylycz et al., 2012; Maston et al. , 2006).В геноме млекопитающих было идентифицировано от 400000 до 1,4 миллиона предполагаемых энхансеров с помощью различных высокопроизводительных методов, которые выявляют особенности энхансеров, такие как специфические модификации гистонов (Bernstein et al., 2012; Thurman et al., 2012). Количество энхансеров, которые активны в любом одном типе клеток, оценивается в десятки тысяч, а активность энхансеров в значительной степени зависит от типа клеток (Bernstein et al., 2012; Heintzman et al., 2009; Shen et al. , 2012; Visel et al., 2009; Ип и др., 2012).

В эмбриональных стволовых клетках (ESC) контроль над программой экспрессии генов, которая устанавливает и поддерживает состояние ESC, зависит от удивительно небольшого числа основных факторов транскрипции (Ng and Surani, 2011; Orkin and Hochedlinger, 2011; Young, 2011) . Эти факторы транскрипции, которые включают Oct4, Sox2 и Nanog, связываются с энхансерами вместе с коактиваторным комплексом Mediator (Kagey et al., 2010). Комплекс Mediator облегчает способность связанных с энхансером факторов транскрипции рекрутировать РНК Pol II на промоторы генов-мишеней (Borggrefe and Yue, 2011; Conaway and Conaway, 2011; Kornberg, 2005; Malik and Roeder, 2010) и необходим для поддержание состояния ESC и эмбрионального развития (Ito et al., 2000; Kagey et al., 2010; Рисли и др., 2010).

ESC очень чувствительны к пониженным уровням медиатора. В самом деле, снижение уровней многих субъединиц Mediator вызывает такую ​​же быструю потерю экспрессии ESC-специфических генов, что и потеря Oct4 и других основных факторов транскрипции (Kagey et al., 2010). Неясно, почему пониженные уровни Mediator, общего коактиватора, могут фенокопировать эффекты пониженных уровней Oct4 в ESC.

Интерес к дальнейшему пониманию важности медиатора в ESCs привел нас к дальнейшим исследованиям энхансеров, связанных с основными факторами транскрипции и медиатором в этих клетках.Мы обнаружили, что большая часть связанного с энхансером медиатора занимает исключительно большие энхансерные домены и что эти домены связаны с генами, которые играют важную роль в биологии ESC. Было обнаружено, что эти большие домены или суперэнхансеры содержат высокие уровни ключевых факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, чтобы стимулировать более высокую транскрипционную активность, чем типичные энхансеры, и были исключительно чувствительны к пониженным уровням медиатора. . Суперэнхансеры были обнаружены в большом количестве дифференцированных типов клеток, опять же связанных с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в контроле их программы экспрессии генов.Эти результаты показывают, что суперэнхансеры управляют генами, необходимыми для идентификации клеток многих типов клеток млекопитающих.

Результаты

Большие геномные домены, занятые главными факторами транскрипции и медиатором в ESC

Предыдущие исследования показали, что совместная занятость геномных сайтов ESC факторами транскрипции Oct4, Sox2 и Nanog в высокой степени предсказывает активность энхансера (Chen et al. ., 2008), и этот посредник обычно ассоциируется с этими сайтами (Kagey et al., 2010).Мы создали высококачественные наборы данных ChIP-Seq для Oct4, Sox2 и Nanog (OSN) в мышиных ESC и идентифицировали 8 794 сайта, которые совместно заняты этими тремя факторами транскрипции, чтобы аннотировать энхансеры в ESC (таблица S1, данные S1). Изучение энхансеров в нескольких генах, играющих важную роль в биологии ESC, выявило необычную особенность: большой домен, содержащий кластеры составляющих энхансеров (). В то время как подавляющее большинство энхансеров охватывает сегменты ДНК размером в несколько сотен пар оснований (), некоторые части генома содержат кластеры энхансеров размером до 50 килобайт ().Мы обнаружили, что энхансеры ESC можно разделить на два класса в зависимости от уровней медиатора: один класс включает подавляющее большинство энхансеров, а другой — 231 большой домен энхансера (). Примерно 40% сигнала медиатора, связанного с энхансерами, было обнаружено в этих 231 энхансерных доменах. Ключевые особенности 231 домена, содержащего высокие уровни медиатора, которые мы называем суперэнхансерами, заключаются в следующем: 1) они охватывают участки ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и 2) они имеют уровни медиатора, которые являются по крайней мере, на порядок больше, чем у типичного энхансера ().

Энхансеры и суперэнхансеры в ESC

A, B) Профили связывания ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) для факторов транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (OSN), а также коактиватора медиатора (Med1 ) в локусах Gck и miR-290-295 в ESC. Генные модели изображены под профилями связывания. Полосы улучшения и масштабные линейки изображены над профилями привязки.

C) Распределение сигнала Mediator ChIP-Seq (общее количество чтений) по 8 794 энхансерам ESC.Занятость медиатора неравномерно распределяется по участкам энхансеров, при этом подмножество энхансеров (231 супер-энхансер) содержит исключительно высокие количества медиатора.

D) метагенов медиаторной плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) по 8 563 типичным энхансерам и 231 супер-энхансерам. Метагены сосредоточены в области энхансера (703 пары оснований для типичных энхансеров и 8,7 килобайт для суперинхансеров), при этом 3 килобайта окружают каждую энхансерную область.Под метагенами показаны кратные различия ChIP-Seq для функций энхансеров. Медиатор, h4K27ac, h4K4me1 и гиперчувствительность к DNaseI у суперэнхансеров по сравнению с типичными энхансерами. Разница в кратности для энхансеров относится к среднему сигналу ChIP-Seq (общее количество считываний) в суперунхансерах, деленному на средний сигнал ChIP-Seq в типичных энхансерах. Разница в кратности для компонентов энхансера относится к средней плотности ChIP-Seq (считываний на миллион на пару оснований) в компонентах супер-энхансера, деленной на среднюю плотность ChIP-Seq в типичных компонентах энхансера.См. Также рисунок S1A и данные S1.

E) Распределение медиатора, h4K27ac, h4K4me1, гиперчувствительность к DNaseI и нормализованный сигнал ChIP-Seq по OSN в подмножестве 8 794 энхансеров ESC. Для каждой характеристики энхансера график нормализовали путем деления сигнала ChIP-Seq на каждом энхансере ESC на максимальный сигнал ChIP-Seq. Энхансеры на оси X ранжируются для каждой особенности энхансера независимо (т.е. точный энхансер в позиции 8000 отличается для каждой функции энхансера).Оси x и y отрегулированы так, чтобы можно было визуализировать различия в распределении каждой из функций усилителя. См. Также рисунок S1B.

F) профилей связывания ChIP-Seq для Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb в локусах Gck и miR-290-295 в ESC.

G) Метагены Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq с плотностью по составляющим энхансерам в пределах 8 563 типичных энхансеров и 231 области суперэнхансеров.Каждый метаген центрирован на составляющем энхансере с 2 килобайтами, окружающими составляющую энхансерную область.

H) Коробчатые диаграммы плотности Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb ChIP-Seq на составляющих энхансерах в 8 563 типичных энхансерах и 231 суперэнхансерах. P-значения (Oct4 = 0,012, Nanog = 10 −4 , Sox2 = 0,11, Klf4 = 10 −34 , Esrrb = 10 −25 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

I) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в областях суперэнхансера относительно геномного фона, и связанные с ними p-значения.CTCF и c-Myc не обогащены.

Дж) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество мотивов связывания Oct4, Sox2 или Nanog в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, График в виде прямоугольников, изображающий количество мотивов связывания Klf4 или Esrrb в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерных областях. P-значения (Oct4 / Sox2 / Nanog = 0,36, Klf4 / Esrrb = 10 -45 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Дальнейшая характеристика областей суперэнхансеров ESC показала, что они содержат многие особенности типичных энхансеров, но в значительно большем масштабе (Рисунок S1A). Предыдущие исследования показали, что нуклеосомы с гистоновыми модификациями h4K27ac и h4K4me1 обогащены активными энхансерами (Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Основываясь на данных ChIP-Seq, уровни этих модификаций гистонов в суперэнхансерах превышают уровни в типичных энхансерах, по крайней мере, на порядок ().Эти высокие уровни модификаций гистонов обусловлены как размером домена, так и плотностью заполнения составляющих энхансеров (). Аналогичные результаты были получены для гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. S1A), еще одной особенности энхансеров (Dunham et al., 2012). Мы сравнили относительную способность данных ChIP-Seq для OSN, Mediator, h4K27ac, h4K4me1, а также данных о гиперчувствительности к DNaseI, чтобы отличить суперэнхансеры от типичных энхансеров (расширенные экспериментальные процедуры и рисунок S1B). Мы обнаружили, что Mediator работает оптимально, хотя каждая из этих функций энхансеров может быть использована в некоторой степени для отличия суперэнхансеров от типичных энхансеров (рис. S1B).

Чтобы выяснить, есть ли у суперэнхансеров особенности, которые могут еще больше отличить их от типичных энхансеров, мы изучили данные ChIP-Seq для 18 различных факторов транскрипции, модификаций гистонов, регуляторов хроматина, а также гиперчувствительности к ДНКазе I (Таблица S2). Наиболее разительное различие было в занятости факторов транскрипции Klf4 и Esrrb (). В то время как уровни Oct4, Sox2 и Nanog были схожими в составе энхансеров в типичных энхансерах и супер-энхансерах (p-val.= 0,012, 10 -4 и 0,11, соответственно), уровни Klf4 и Esrrb показали значительно более высокую степень заполнения составляющими энхансерами суперинхансерных доменов (p-val. <10 -34 и 10 -25 соответственно) (). Таким образом, суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в перепрограммировании соматических клеток в индуцированный плюрипотентный ствол (iPS). клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Цзян и др., 2008; Мартелло и др., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши и Яманака, 2006).

Чтобы получить дополнительную информацию о механизмах, участвующих в образовании суперэнхансеров, мы изучили частоту известных мотивов связывания факторов транскрипции в этих и других регионах генома. Мы обнаружили, что составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены мотивами последовательностей, связанными Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb, но не мотивами, связанными с другими факторами транскрипции, экспрессируемыми в ESC, такими как CTCF и c-Myc ().Мотивы последовательностей Oct4, Sox2 и Nanog показали аналогичные уровни обогащения у типичных энхансеров и составляющих энхансеров в пределах суперэнхансерных доменов, но мотивы для Klf4 и Esrrb были значительно обогащены составляющими энхансерами в суперэнхансерах (p-val. <10 −45 ) (). Эти данные показывают, что суперэнхансеры ESC представляют собой большие кластеры энхансеров, которые можно отличить от типичных энхансеров по присутствию факторов транскрипции Klf4 и Esrrb и исключительным уровням медиатора, и указывают на то, что эти домены образуются в результате связывания специфических энхансеров. управляют факторами транскрипции до плотных кластеров их последовательностей сайтов связывания.

Суперэнхансеры связаны с ключевыми генами идентичности ESC.

Энхансеры имеют тенденцию замыкаться петлей и связываться с соседними генами, чтобы активировать их транскрипцию (Ong and Corces, 2011). Большинство этих взаимодействий происходит на расстоянии ~ 50 kb от энхансера, хотя многие могут происходить на больших расстояниях до нескольких мегабаз (Sanyal et al., 2012). В предыдущих исследованиях использовались различные методы для присвоения энхансеров их генам-мишеням, включая близость, назначение энхансер-промоторных единиц (EPU) и общегеномные взаимодействия, обнаруженные с помощью методов захвата конформации хромосом (Dixon et al., 2012; Шен и др., 2012; Уайт и др., 2012). Первоначально мы использовали близость, чтобы отнести 231 суперэнхансер к 210 генам (Таблица S1), потому что суперэнхансеры имеют тенденцию перекрывать гены, с которыми они были связаны. Эти определения близости суперинхансера были очень согласованы (95% совпадение) с назначениями EPU (таблица S3). Кроме того, 93% пар суперинхансер-промотор, идентифицированных по близости, встречаются в одних и тех же топологических доменах, определенных Hi-C (Таблица S3). Кроме того, для трех из этих генов ( Oct4 , Nanog и Lefty1 ) взаимодействия между частями суперэнхансера и целевого промотора ранее были продемонстрированы с использованием захвата конформации хроматина (3C) (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры связаны с ключевыми генами плюрипотентности ESC.

A) ChIP-Seq профилей связывания для OSN и Med1 в локусе Klf4 в ESC. Ранее описанная частота взаимодействия Hi-C (нормализованное количество взаимодействий) и координаты генома, составляющие часть топологического домена (Dixon et al., 2012), указаны над профилями связывания.

B) Профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах Oct4 и Sox2 в ESC.Генные модели изображены под профилями связывания.

C) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии ESC.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, кодирующими факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, важные для поддержания состояния ESC. Анализ обогащения набора генов (GSEA) генов, связанных с суперэнхансерами, показывает, что эти гены кодируют регуляторы, нокдаун shRNA которых больше всего влияет на экспрессию Oct4 и состояние ESC.Нокдаун генов, важных для идентичности ESC, вызывает потерю Oct4, что отражается отрицательным Z-показателем. P-значение (10 -2 ) было рассчитано как часть анализа GSEA.

E) Функциональные категории онтологии генов (GO) для генов, связанных с суперэнхансерами. Гены, кодирующие факторы, важные для синтеза ДНК, синтеза белка и метаболизма, не были обогащены. См. Также рисунок S2.

F) Принципиальная схема небольшой части основной регулирующей схемы ESC.Гены, кодирующие основные факторы транскрипции, сами управляются суперэнхансерами. Эти главные факторы образуют взаимосвязанную петлю обратной связи и регулируют свою собственную экспрессию, а также экспрессию других факторов транскрипции и некодирующих РНК, которые играют важную роль в биологии ESC.

Набор генов, связанных с суперэнхансером, содержал почти все гены, которые участвовали в контроле идентичности ESC (Таблица S1). Они включали гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog (Таблица S1).Они также включали гены, кодирующие большинство других факторов транскрипции, участвующих в контроле идентичности ESC, а также гены, кодирующие ДНК-модифицирующие ферменты и miRNA, которые играют важную роль в контроле программы экспрессии генов ESC (). Например, Klf4 и Esrrb играют важную роль в биологии ESC и могут способствовать репрограммированию (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Такахаши, Яманака, 2006). Продукты генов Tet связаны с наиболее активными промоторами и ответственны за глобальное 5-гидроксиметилирование ДНК в ESC (Wu et al., 2011; Ю. и др., 2012а). Локус miR-290-295 продуцирует наиболее многочисленные miRNAs в ESC (Calabrese et al., 2007) и важен для выживания эмбрионов (Medeiros et al., 2011).

Предыдущие исследования идентифицировали гены, кодирующие широкий спектр факторов транскрипции, коактиваторов и регуляторов хроматина, которые необходимы для поддержания состояния ESC (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Kagey et al., 2010). Для дальнейшего изучения степени, в которой гены, связанные с суперэнхансером, участвуют в контроле состояния ESC, мы сравнили набор генов, связанных с суперэнхансером, с генами в скрининге нокдауна короткой шпилечной РНК (shRNA) с участием 2000 регуляторов, которые включены большинство факторов транскрипции и регуляторов хроматина, кодируемых в геноме мыши (Kagey et al., 2010). Мы обнаружили, что большинство генов, кодирующих факторы транскрипции, коактиваторы и регуляторы хроматина, нокдаун которых наиболее серьезно вызвал потерю состояния ESC, связаны с суперинхансерами (p-val. <10 -2 ) (). Это дополнительно подтверждает представление о том, что гены, связанные с суперэнхансерами, кодируют многие регуляторы, которые являются ключевыми для установления и поддержания состояния ESC.

Гены, кодирующие факторы транскрипции, были преобладающим классом генов, связанных с суперэнхансерами, на основе анализа функциональных категорий генной онтологии ().Напротив, суперинхансеры не были связаны с генами домашнего хозяйства (рис. S2). Ранее было показано, что главные факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2 и Nanog образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, где все три фактора связываются как группа с промоторами каждого из своих генов и образуют основную регуляторную цепь ESC (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Открытие Klf4 и Esrrb в суперэнхансерах и доказательство того, что Klf4 и Esrrb играют важную роль в программе экспрессии гена ESC и в репрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Takahashi and Yamanaka, 2006) предполагают, что эта ауторегуляторная петля должна быть расширена, чтобы включить Klf4 и Esrrb ().

Функциональные атрибуты суперэнхансеров

Гены, связанные с суперэнхансерами, обычно экспрессируются на более высоких уровнях, чем гены, связанные с типичными энхансерами (p-val. <10 -5 ) (Рисунок S3A, Таблица S4), что позволяет предположить суперэнхансеры обеспечивают высокий уровень экспрессии своих генов-мишеней. Чтобы проверить, обладают ли суперэнхансеры более сильной энхансерной активностью, чем типичные энхансеры ESC, мы клонировали фрагменты ДНК из этих элементов в конструкции репортера люциферазы, которые впоследствии были трансфицированы в ESC.Составляющие сегменты энхансеров в суперэнхансерах, определяемые как область из 600–1400 пар оснований с одним пиком занятости Oct4 / Sox2 / Nanog, генерировали более высокую активность люциферазы по сравнению с отдельными пиками типичных энхансеров (в 3,8 раза выше; p-val. = 0,02) (). Эти результаты согласуются с идеей о том, что суперэнхансеры и их компоненты помогают управлять высокими уровнями транскрипции ключевых генов, контролирующих идентичность ESC.

Суперэнхансеры придают высокую транскрипционную активность и чувствительность к возмущениям

A) Коробчатые диаграммы экспрессии (чтения на килобазу экзона на миллион отображенных считываний (RPKM)) от типичного энхансера, суперэнхансера и всех энхансеров -ассоциированные гены, а также 1000 самых высоко экспрессируемых генов домашнего хозяйства.Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −5 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3A и таблицу S4.

Б) Верхняя панель , профили связывания ChIP-Seq для OSN и Med1 в локусах типичного энхансера Sgk1 и суперэнхансера Esrrb . Серые полосы с пунктирными границами обозначают клонированные области. Нижняя панель , График активности люциферазы через 24 часа после трансфекции, нормализованный по трансфицированной контрольной плазмиде.Соседние выбранных генов энхансеров клонировали в репортерные плазмиды, содержащие ген люциферазы , регулируемый промотором Oct4 , и затем трансфицировали в ESC. P-значение (0,02) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3B.

С) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против Oct4. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы изменения кратности экспрессии дифференцирующихся ESC (3, 4 и 5 дней после трансдукции) относительно контрольных ESC, трансдуцированных shRNA против GFP.P-значения (день 3 = 10 −5 , день 4 = 10 −8 , день 5 = ​​10 −10 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия. См. Также рисунок S3C.

Г) Верхняя панель , схематическая диаграмма ЭСК, трансдуцированных кшРНК против медиаторной субъединицы Med12. Нижняя панель , прямоугольные диаграммы экспрессии кратных изменений в ЭСК, обедненных медиатором (3, 4 и 5 дней после трансдукции), по сравнению с контрольными ЭСК. P-значения (день 3 = 10 −11 , день 4 = 10 −11 , день 5 = ​​10 −13 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

Чтобы получить ключ к разгадке факторов, которые способствуют более высокой активности отдельных элементов энхансера в суперэнхансерах, мы определили, коррелируют ли уровни определенных факторов транскрипции в элементах энхансера на основе данных ChIP-Seq для локуса генома с уровни активности люциферазы в репортерных анализах. Присутствие Klf4 и Esrrb коррелировало с высокими уровнями активности люциферазы (рисунок S3B). Таким образом, Klf4 и Esrrb, которые особенно обогащены супер-энхансерами (), могут способствовать превосходной активности энхансерных элементов из супер-энхансеров в этих репортерных анализах.

Далее мы исследовали, могут ли функциональные атрибуты суперэнхансеров объяснять наблюдение, что пониженные уровни Oct4 или Mediator имеют очень похожие эффекты на программу экспрессии гена ESC и вызывают такую ​​же быструю потерю состояния ESC (Kagey et al. , 2010). Энхансеры обычно функционируют посредством кооперативного и синергетического взаимодействия между множеством факторов транскрипции и коактиваторами (Carey, 1998; Carey et al., 1990; Giese et al., 1995; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995).Выход транскрипции энхансеров с большим количеством сайтов связывания факторов транскрипции может быть более чувствительным к изменениям концентрации факторов транскрипции, чем энхансеры с меньшим количеством сайтов связывания (Giniger and Ptashne, 1988; Griggs and Johnston, 1991). Поэтому мы предположили, что гены, ассоциированные с суперэнхансерами, могут быть более чувствительны к нарушениям уровней факторов связывания энхансеров, чем гены, ассоциированные с нормальными энхансерами. Мы провели два испытания этой модели.

В ESC снижение уровней Oct4 приводит к потере экспрессии и дифференцировки ESC-специфических генов. Если гены, связанные с суперэнхансером, более чувствительны к потере основных факторов транскрипции, чем другие гены, то снижение уровней Oct4 должно вызывать преимущественную потерю экспрессии генов, связанных с суперэнхансером. Чтобы проверить эту идею, мы снизили уровни транскрипции Oct4 с помощью shRNA, что привело к активации основного фактора транскрипции трофэктодермы Cdx2 и клеточной дифференцировке () (Deb et al., 2006; Нива и др., 2005; Strumpf et al., 2005). Истощение Oct4 приводит к изменениям клеточной морфологии в соответствии с дифференцировкой ESC через 5 дней (Рисунок S3C). Мы проанализировали экспрессию генов через 3, 4 и 5 дней после истощения Oct4, и наблюдали, что гены, связанные с супер-энхансером, испытали более раннее и более глубокое снижение уровней транскриптов, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 −5 , 10 −8 и 10 −10 соответственно) (). Эти результаты показывают, что транскрипционный выход генов, связанных с суперэнхансером ESC, быстро и предпочтительно снижается во время дифференцировки.

Если гены, ассоциированные с суперэнхансером, более чувствительны к потере коактиваторов, чем другие гены, то снижение уровней субъединиц медиатора должно преимущественно влиять на экспрессию генов, ассоциированных с суперэнхансером. Когда уровни медиатора были снижены с использованием shRNA в ESC, наиболее выраженные эффекты на экспрессию генов наблюдались в генах, связанных с суперэнхансером (p-val. <10 −11 , 10 −11 и 10 — 13 соответственно) (). Таким образом, эти результаты показывают, что снижение уровней Oct4 и Mediator приводит к более глубокому влиянию на экспрессию генов, связанных с суперэнхансерами, чем на другие активные гены с типичными энхансерами.Эти результаты могут, таким образом, объяснить наблюдение, что потеря Oct4 и потеря субъединиц Mediator имеют сходные эффекты на состояние ESC (Kagey et al., 2010).

Супер-энхансеры в B-клетках

Мы исследовали, имеют ли супер-энхансеры, обнаруженные в ESC, аналогичные аналоги в дифференцированных клетках. Мы аннотировали 13814 энхансеров, используя данные ChIP-Seq для основного фактора транскрипции PU.1 в мышиных клетках-предшественниках B (про-B) (таблица S5) (DeKoter and Singh, 2000; Nutt and Kee, 2007).Предыдущие исследования показали, что занятость про-B геномных сайтов PU.1 является предиктором активности энхансера (Abujarour et al., 2010; Wlodarski et al., 2007). Мы обнаружили, что полногеномная занятость основного фактора транскрипции PU.1 и медиатора сильно коррелировала (рис. S4). Когда уровни медиатора были нанесены на график в зависимости от энхансеров, ранжированных по сигналу ChIP-Seq, энхансеры в этих клетках подразделялись на два класса, как это наблюдалось для ESC (). Про-В-клетки имели 395 больших доменов, которые имели общие ключевые характеристики с суперэнхансерами, обнаруженными в ESC: они охватывали домены ДНК, средняя длина которых на порядок больше, чем у типичного энхансера, и у них были уровни медиатора, по крайней мере, равные на порядок больше, чем у типичного энхансера ().Почти 40% всего сигнала медиатора, наблюдаемого на энхансерах, было связано с доменами суперэнхансера в про-В-клетках.

Супер-энхансеры в про-B-клетках

A) ChIP-Seq профилей связывания для PU.1 и Med1 в локусе Foxo1 в про-B-клетках.

B) Распределение плотности ChIP-Seq медиатора по 13 814 энхансерам pro-B, с подмножеством энхансеров (395 суперэнхансеров), содержащих исключительно высокие количества медиатора. См. Также рисунок S4.

C) Метагены медиатора плотности в типичных и супер-энхансерах в клетках proB. Метагены сосредоточены в области энхансера (422 пары оснований для типичных энхансеров и 15,4 kb для суперинхансеров), при этом 3kb окружают каждую область энхансера. Разница в кратности ChIP-Seq для медиатора в супер-энхансерах по сравнению с типичными энхансерами отображается под метагенами.

D) Таблица, показывающая мотивы связывания фактора транскрипции, обогащенные составляющими энхансерами в пределах суперэнхансерных областей, относительно геномного фона и связанных значений p.CTCF и Zfx не обогащаются.

E) Левая панель , прямоугольная диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов PU.1, Ebf1 или Foxo1 в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперэнхансерах. Правая панель, Блок-диаграмма, изображающая количество связывающих мотивов E2A в составляющих энхансерах в типичных энхансерах и составляющих энхансерах в суперинхансерных областях. P-значения (PU.1 / Ebf1 / Foxo1 = 10 −5 , E2A = 10 −22 ) были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия.

F) Список выбранных генов, связанных с суперэнхансерами и играющих важную роль в биологии В-клеток.

G) Графики экспрессии типичных энхансеров, суперэнхансеров и всех генов, ассоциированных с энхансерами, в про-В-клетках. Обозначено количество генов, принадлежащих к каждой категории, для которой у нас есть данные об экспрессии. P-значение (10 −6 ) было рассчитано с использованием двустороннего t-критерия.

Мы изучили частоту последовательностей ДНК, связанных с факторами транскрипции про-В в суперэнхансерах и в других областях генома.Составляющие энхансеры в суперэнхансерных областях были значительно обогащены кластерами мотивов последовательностей, связанных с PU.1, а также набором других факторов транскрипции, которые участвовали в контроле В-клеток (2). Факторы транскрипции с обогащением мотивов последовательности в суперэнхансерных доменах включают Ebf1, E2A и Foxo1, которые, как ранее было показано, важны для контроля В-клеток (Lin et al., 2010). Мотив последовательности для E2A был значительно больше обогащен компонентами суперэнхансера по сравнению с типичными составляющими энхансера (p-val.<10 −22 ) (). E2A необходим для развития про-B-клеток во время B-клеточного лимфопоэза (Kwon et al., 2008). Эти данные согласуются с результатами, полученными для ESCs, где мотивы последовательностей ДНК для основных факторов транскрипции были обогащены близко расположенными кластерами.

Затем мы идентифицировали гены, связанные с суперэнхансерами в про-В-клетках, и обнаружили, что многие из них являются важными регуляторами идентификации В-клеток (). Например, гены, связанные с суперэнхансером, в про-В-клетках включали Foxo1 и Inpp5d .В обычных лимфоидных предшественниках Foxo1 действует совместно с Ebf1, определяя судьбу В-клеток как часть петли положительной обратной связи (Mansson et al., 2012), в то время как фермент, метаболизирующий липиды, кодируемый Inpp5d, SHIP1, дефосфорилирует белки для регулирования сигнальный ответ B-клеточного рецептора антигена (BCR) (Alinikula et al., 2010). Как и в ESC, гены, связанные с суперэнхансерами в про-B-клетках, экспрессировались на более высоких уровнях, чем те, которые связаны с типичными энхансерами (p-val. <10 -6 ) (, Таблица S5).

Супер-энхансеры являются клеточными типами и маркируют ключевые гены идентификации клеток.

. факторы транскрипции, которые контролируют состояние клеток, хорошо определены (). Мы обнаружили, что главные факторы транскрипции мышечных трубок (MyoD), Т-хелперные (Th) клетки (T-Bet) и макрофаги (C / EBPα) также связывают большие домены с кластерами энхансеров (Рисунок S5A, B), и эти большие домены связаны с генами, которые преимущественно присутствуют в биологии этих клеток (Рисунок S5C, Таблица S6).В мышечных трубках, например, суперинхансер связан с геном, кодирующим MyoD, который является главным регулятором скелетных мышц и первым показателем репрограммирования фибробластов в мышечные клетки (Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1989). В клетках Th суперэнхансер связан с геном Tcf7 , который кодирует фактор 1 Т-клеток (Tcf-1), который имеет решающее значение для продукции Т-клеток во время гематопоэза (Staal and Sen, 2008; Xue and Zhao, 2012; Yu et al., 2012б). В макрофагах суперэнхансер связан с геном, кодирующим гликопротеин внеклеточного матрикса Thbs-1, который участвует в распознавании скавенджером апоптотических клеток макрофагами (Savill et al., 1992). Эти результаты подтверждают идею о том, что ключевые факторы транскрипции, контролирующие состояние клетки, связываются с кластерами энхансеров, которые связаны с конкретными генами, которые являются ключевыми для идентичности клетки.

Суперэнхансеры обычно связаны с ключевыми генами идентификации клеток

A) Профили связывания ChIP-Seq для основных факторов транскрипции (OSN в ESC; PU.1 в pro-B клетках; MyoD в мышечных трубках; T-bet в Th-клетки; C / EBPα в макрофагах), в локусах Esrrb , Inpp5d , Myod1 , Tcf7 и Thbs-1 .См. Также рисунок S5A, B.

B) Диаграммы Венна типичных энхансер-ассоциированных и супер-энхансерных генов в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница) и мышечных трубках (оранжевая граница).

C) Диаграммы Чоу-Риски типичных генов, связанных с энхансером, и генов, связанных с суперэнхансером, в ESC (синяя граница), про-B-клетках (зеленая граница), мышечных трубках (оранжевая граница), Th-клетках (коричневая граница) и макрофаги (фиолетовая кайма). Цвет границ вокруг каждого пересечения соответствует типам клеток, гены которых перекрываются.Красный кружок посередине представляет собой перекрытие всех 5 типов ячеек. Более светлые оттенки красного, оранжевого и желтого представляют собой перекрытие меньшего количества типов клеток. Площадь каждого пересечения пропорциональна количеству генов в пересечении.

D) Суперэнхансеры связаны с генами, играющими важную роль в биологии, специфичной для определенного типа клеток. Показаны 10 основных терминов онтологии генов, связанных с суперэнхансерами в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах.P-значения, соответствующие каждому из терминов генной онтологии, отображаются в виде цветовой полосы, с полосой цветовой шкалы, обозначенной ниже. См. Также рисунок S5C, D.

Набор энхансеров, которые связываются факторами транскрипции и контролируют транскрипцию в любом одном типе клеток, может способствовать экспрессии как генов, специфичных для определенного типа клеток, так и генов, активных во многих типах клеток (Bernstein et al., 2012; Shen et al. ., 2012; Ип и др., 2012). Элементы суперэнхансера, идентифицированные в ESC, про-B-клетках, мышечных трубках, Th-клетках и макрофагах, охватывают домены, которые почти полностью были типоспецифичными (рис. S5D), а гены, связанные с этими элементами, были в высокой степени типоспецифичными по отношению к типу клеток. типичные гены, ассоциированные с энхансерами ().Эти результаты согласуются с идеей, что суперэнхансеры образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции с кластерами сайтов связывания, которые связаны с генами, контролирующими уникальные клеточные идентичности.

Если суперэнхансеры обычно образуются в генах, функции которых связаны с идентичностью клеток, мы можем ожидать, что гены, связанные с суперэнхансерами, будут определять тип клетки. Когда анализ онтологии генов был проведен с использованием набора генов, связанных с суперэнхансерами в каждом типе клеток, мы обнаружили, что 10 наиболее значимых терминов биологических процессов, полученных для каждого типа клеток, в значительной степени описывают специфическую функцию каждой клетки ().Этот результат предполагает, что гены, связанные с суперэнхансерами, могут быть ценными биомаркерами для идентификации клеток.

Обсуждение

Мы идентифицировали исключительно большие энхансерные домены, которые заняты основными факторами транскрипции и связаны с генами, кодирующими ключевые регуляторы клеточной идентичности. В ESC эти суперэнхансеры состоят из кластеров энхансерных элементов, которые образуются путем связывания ключевых факторов транскрипции и комплекса коактиватора медиатора. Суперэнхансеры ESC отличаются от типичных энхансеров размером, плотностью и содержанием факторов транскрипции, способностью активировать транскрипцию и чувствительностью к возмущениям.Супер-энхансеры обнаруживаются во множестве других типов клеток, где они связаны с ключевыми типами клеток генами, которые, как известно, играют важную роль в их биологии. Эти результаты предполагают участие суперэнхансеров в контроле идентичности клеток млекопитающих.

Образование суперэнхансера, по-видимому, происходит в результате связывания больших количеств основных факторов транскрипции с кластерами последовательностей ДНК, которые относительно многочисленны в этих больших доменах. Факторы транскрипции ESC Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Esrrb имеют ДНК-связывающие мотивы, которые обогащены суперэнхансерными доменами.Суперэнхансеры — это не просто кластеры типичных энхансеров, они особенно обогащены Klf4 и Esrrb, которые, как ранее было показано, играют важную роль в программе экспрессии генов ESC и в перепрограммировании соматических клеток в iPS-клетки (Feng et al., 2009; Festuccia et al., 2012; Jiang et al., 2008; Martello et al., 2012; Percharde et al., 2012; Takahashi, Yamanaka, 2006). Кроме того, гены, связанные с суперэнхансером, очень чувствительны к снижению уровней факторов и кофакторов, связанных с энхансером.Мы предполагаем, что сигналы, которые естественным образом вызывают дифференциацию ЭСК, могут использовать эту чувствительность генов, связанных с суперэнхансерами, для облегчения перехода к новым программам экспрессии генов.

Примечательно, что гены, кодирующие основные факторы транскрипции ESC, сами управляются суперэнхансерами, образуя петлю обратной связи, в которой ключевые факторы транскрипции регулируют свою собственную экспрессию (). Более ранние исследования идентифицировали часть этой взаимосвязанной ауторегуляторной петли, состоящую из генов, кодирующих Oct4, Sox2 и Nanog, но не знали о необычной структуре энхансера, связанной с генами в этой регуляторной петле (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Образование суперэнхансеров у этих генов также представляет интерес, потому что это предполагает, что суперэнхансеры могут вообще идентифицировать гены, которые важны для контроля клеточной идентичности и, в некоторых случаях, способны перепрограммировать клеточную судьбу. Действительно, мы нашли доказательства наличия суперэнхансеров, связанных с генами, которые контролируют клеточную идентичность в широком диапазоне типов клеток, и некоторые из этих генов действительно кодируют факторы, которые, как было продемонстрировано, репрограммируют судьбу клеток.

Мы обнаружили, что суперэнхансеры можно идентифицировать путем поиска кластеров сайтов связывания для факторов транскрипции, связывающих энхансер, и их можно отличить от типичных энхансеров по заселенности кофакторов или суррогатных меток, связанных с энхансером, таких как гистон h4K27ac или гиперчувствительность к ДНКазе. .Предыдущие исследования показали, что многие различные факторы транскрипции ESC могут связываться с сайтами, называемыми множественными локусами связывания факторов транскрипции (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008), но эти локусы отличаются от суперэнхансеров и связаны с разными гены. Другие исследования также идентифицировали большие геномные домены, участвующие в контроле генов, но не отметили, что гены, кодирующие ключевые регуляторы состояния клетки, обычно управляются суперэнхансерами. Например, большие контрольные области с кластерами сайтов связывания факторов транскрипции или сайтов гиперчувствительности к ДНКазе были описаны для энхансера IgH (~ 20 т.п.н.), рецептора Th-клеток (~ 11.5kb), β-глобиновый энхансер (~ 16kb) и другие (Diaz et al., 1994; Forrester et al., 1990; Grosveld et al., 1987; Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995; Orkin , 1990). Возможно, что в предыдущих исследованиях не были отмечены большие области активности энхансера, связанные с ключевыми генами клеточной идентичности, потому что большинство существующих алгоритмов обычно ищут доказательства связывания факторов или гиперчувствительности ДНКазы I в небольших областях генома. Однако существуют алгоритмы, предназначенные для идентификации больших доменов (Ernst and Kellis, 2010; Filion et al., 2010; Hon et al., 2008; Thurman et al., 2012), и описанный здесь алгоритм должен быть полезен для дальнейшего открытия суперэнхансеров и других больших доменов.

Присутствие суперэнхансеров в ключевых генах идентификации клеток обеспечивает новое понимание транскрипционного контроля клеток млекопитающих. Описанные здесь данные указывают на то, что в геномах млекопитающих развились кластеры последовательностей ДНК рядом с генами, кодирующими ключевые факторы состояния клетки. Эти кластеры связаны комбинацией ключевых факторов транскрипции с образованием суперинхансеров, специфичных для определенного типа клеток, и таким образом контролируют программы экспрессии генов, связанные с определенными клеточными идентичностями.

Концепция суперэнхансеров может способствовать картированию регуляторных схем многих различных типов клеток, включая млекопитающих. Обнаружение того, как тысячи факторов транскрипции взаимодействуют для управления программами экспрессии генов в огромном количестве клеток позвоночных, является очень сложной задачей. Однако, если только несколько сотен суперэнхансеров доминируют в контроле над ключевыми генами, которые устанавливают и поддерживают клеточную идентичность, возможно создание базовых моделей, которые описывают ключевые особенности транскрипционного контроля состояния клетки.

Экспериментальные процедуры

Культура клеток

ЭСК мыши V6.5 выращивали на облученных эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки выращивали в стандартных условиях ESC, как описано ранее (Whyte et al., 2012). Клетки выращивали на 0,2% желатинизированных (Sigma, G1890) планшетах для тканевых культур в среде ESC; DMEM-KO (Invitrogen, 10829-018) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, охарактеризован как Sh4007103), 1000 ед / мл LIF (ESGRO, ESG1106), 100 мкМ заменимых аминокислот (Invitrogen, 11140-050), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, 25030-081), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 8 нл / мл 2-меркаптоэтанола (Sigma, M7522).

ChIP-Seq

ChIP выполняли, как описано ранее (Boyer et al., 2005). Дополнительные сведения приведены в расширенных экспериментальных процедурах. ChIP-Seq медиатора получали с использованием антитела Med1 (Bethyl Labs A300-793A, Lot # A300-793A-2).

Illumina Секвенирование и создание библиотеки

Очищенную ChIP ДНК использовали для получения библиотек мультиплексного секвенирования Illumina. Библиотеки для секвенирования Illumina были подготовлены в соответствии с протоколом набора для подготовки образцов ДНК Illumina TruSeq v2 с исключениями, описанными в расширенных экспериментальных процедурах.

Конструкции экспрессии люциферазы

Минимальный промотор Oct4 амплифицировали из геномной ДНК мыши и клонировали в сайты XhoI и HindIII основного вектора pGL3 (Promega). Затем фрагменты энхансера клонировали в сайты BamHI и SalI вектора pGL3-pOct4. ЭСК мыши v6.5 трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Плазмиду pRL-SV40 (Promega) котрансфицировали в качестве контроля для нормализации. Клетки инкубировали в течение 24 часов и активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (Promega).Геномные координаты клонированных фрагментов приведены в таблице S7.

Анализ данных

Все наборы данных ChIP-Seq были выровнены с использованием Bowtie (версия 0.12.2) (Langmead et al., 2009) для построения версии MM9 генома мыши или HG18 генома человека. Идентификатор доступа GEO для выровненных и необработанных данных: {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE44288», «term_id»: «44288»}} GSE44288 (www.ncbi.nlm .nih.gov / geo /). Наборы данных, использованные в этой рукописи, можно найти в Таблице S8.

Мы разработали простой метод для расчета нормализованной плотности чтения набора данных ChIP-Seq в любом регионе.Считывания ChIP-Seq, выравнивающиеся по области, были увеличены на 200 пар оснований, и была рассчитана плотность считываний на пару оснований (bp). Плотность считываний в каждой области была нормализована к общему количеству миллионов отображенных считываний, дающих плотность считывания в единицах считываний на миллион сопоставленных считываний на пару оснований (об / мин / пар оснований)

Мы использовали MACS версии 1.4.1 (анализ на основе модели ChIP-Seq) (Zhang et al., 2008) алгоритм поиска пиков для выявления областей обогащения ChIP-Seq на фоне. Для всех наборов данных использовалось пороговое значение p для обогащения 10 −9 .

Энхансеры были определены как области обогащения ChIP-Seq для фактора (ов) транскрипции. Чтобы точно захватить плотные кластеры энхансеров, мы позволили сшить области в пределах 12,5 КБ друг от друга.

Методы идентификации и характеристики суперэнхансеров, а также отнесение энхансеров к генам полностью описаны в расширенных экспериментальных процедурах.

Динамический баланс между основными факторами транскрипции определяет судьбу и функции субпопуляций Т-лимфоцитов CD4 и врожденных лимфоидных клеток

Рисунок 1.

Сходства и различия между…

Рисунок 1.

Сходства и различия между функциями и развитием Т-хелперных (Th) клеток…

Рисунок 1.

Сходства и различия между функциями и развитием субпопуляций Т-хелперных (Th) клеток и врожденных лимфоидных клеток (ILC). (A) Подмножества Th-клеток и ILC экспрессируют идентичные наборы эффекторных цитокинов и имеют схожие основные факторы транскрипции для их развития и функций. Клетки Th2 и ILC1 важны для защитного иммунитета против вирусов, внутриклеточных бактерий и простейших. Клетки Th3 и ILC2 важны для избавления от гельминтов. Клетки Th27 и ILC3 имеют решающее значение для защитных иммунных ответов против грибков и внеклеточных бактерий. Th3 и ILC2 участвуют в аллергическом воспалении, а Th-клетки 1 и 3 типа и ILC вносят вклад в аутоиммунитет.(B) В тимусе RORγt необходим для выживания CD4 + CD8 + двойных положительных (DP) клеток и реаранжировки TCRα. CD4 + CD8 + DP тимоциты могут развиваться в наивные CD4 + Т-клетки, наивные CD8 + Т-клетки, NKT-клетки и tTreg-клетки посредством индукции ThPOK, Eomes, PLZF и Foxp3 соответственно. GATA3 регулирует экспрессию ThPOK и, таким образом, имеет решающее значение для развития CD4, но не CD8, Т-клеток. После активации Т-клеток наивные CD4 + Т-клетки могут далее развиваться в T-bet-экспрессирующие Th2, GATA3-экспрессирующие Th3 и RORγt-экспрессирующие Th27 клетки.С врожденной стороны, клетки-предшественники NK / ILC, экспрессирующие фактор транскрипции TCF7, могут развиваться в экспрессирующие Eomes обычные NK-клетки, RORγt-экспрессирующие LTi или LTi-подобные клетки и PLZF + GATA3 hi Id2 hi предшественники ILC. . GATA3 имеет решающее значение для генерации предшественников ILC PLZF + GATA3 hi Id2 hi , но не NK-клеток. PLZF + GATA3 hi Id2 hi Предшественники ILC могут далее развиваться в экспрессирующие T-bet ILC1, GATA3 hi ILC2 и RORγt-экспрессирующие ILC3.Клетки Th27, экспрессирующие RORγt, или ILC3 могут дополнительно экспрессировать T-bet, превращаясь в клетки Th2 * с двойной экспрессией RORγt / T-bet или NKp46 + ILC3. ILCP, предшественник ILC.

определение, произношение, транскрипция, словоформы, примеры

существительное
— художник непревзойденного мастерства (синоним: маэстро)

мастер скрипки
один из старых мастеров

— лицо, обладающее общей властью над другими (синоним: господин, повелитель)
— боец, способный побеждать соперников (синоним: высший, победитель)
— руководит работой других
— председатель школы (синоним: директор, учитель)
— оригинальное творение (т.е., аудиозапись), с которого можно сделать копии (синоним: оригинал)
— офицер, имеющий лицензию на командование торговым судном (синоним: капитан, шкипер)
— тот, кто имеет степень магистра от академическое учреждение
— орган, имеющий право обучать учеников (синоним: профессиональный)
— ключ, обеспечивающий доступ повсюду (синоним: паспарту, ключ доступа)
глагол
— быть или стать полностью опытным или опытным в

Она выучил японский менее чем за два года

— встать на вершину; справиться успешно (синоним: преодолеть, преодолеть, подчинить, преодолеть)
— иметь доминирование или силу победить над (синоним: доминировать)

Ее боль полностью преодолела ее
Методы могут справиться с проблемами

— иметь твердое понимание или знание; быть на вершине (синоним: контроль)
прилагательное

Дополнительные примеры

Как раб от него требовалось беспрекословно выполнять приказы своего господина.

Собака всегда подчинялась своему хозяину.

Она мастер своего дела.

… считали себя принадлежащими к высшей расе человечества …

… мастер, изготавливающий изысканную деревянную мебель по собственному проекту …

В колледже она освоила французский язык.

Он полон решимости овладеть каждым аспектом бизнеса.

Собака спасла жизнь своему хозяину.

В этом молодом, малоизвестном претенденте чемпион нашел своего хозяина.

Первый помощник учился, чтобы стать мастером.

Он настоящий лжец.

Сохраните одну копию в качестве эталона для справки, а остальные разошлите.

Вы должны научиться управлять своим темпераментом.

Глубокая скорбь овладевает мной.

Он никогда не мог овладеть математикой.

Формы слова

глагол
I / you / we / they: master
he / she / it: masters
причастие настоящего времени: освоение
прошедшее время: освоено
причастие прошедшего времени: освоено

существительное
единственное число: мастер
множественное число: мастера

Генерировать кДНК для ПЦР в реальном времени

Приложения

Выберите правильный набор PrimeScript для ОТ-ПЦР в реальном времени:


Цитирование продуктов

Комори, Х. et al. α (1) -Кислый гликопротеин активирует CD163 через белковый путь TLR4 / CD14: возможная защита от окислительного стресса, вызванного гемолизом. J. Biol. Chem. 287, 30688–700 (2012).

Лю, Х. et al. Метаболизм и фармакокинетика мангиферина у обычных крыс, крыс без псевдозеродышек и крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом. Drug Metab. Dispos. 40, (2012).

Шимура Ю., Сираива Ю. и Судзуки И.Характеристика субдоменов в N-концевой области гистидинкиназы Hik33 в cyanobacterium Synechocystis sp . PCC 6803. Physiol растительных клеток. 53, 1255–66 (2012).

Tani, H. et al. Полногеномное определение стабильности РНК выявляет сотни короткоживущих некодирующих транскриптов у млекопитающих. Genome Res. 22, 947–56 (2012).

Yasuhara, K. et al. Отсутствие фактора транскрипции теплового шока 1 замедляет рост атрофированной камбаловидной мышцы у мышей. J. Appl. Physiol. 111, 1142–9 (2011).

Zhan, Y. et al. Новое производное таспина, HMQ1611, подавляет рост клеток рака груди через сигнальные пути рецептора эстрогена α и рецептора EGF. Рак Пред. Res. (Фила). 5, 864–73 (2012).

Zhang, X. et al. Редкий аллель OsPPKL1, связанный с длиной зерна, вызывает очень крупные зерна и значительное повышение урожайности риса. Proc. Natl. Акад.Sci. США 109, 21534–9 (2012).

Дополнительная информация о продукте

Информацию об условиях хранения, компонентах продукта и технических характеристиках см. В Сертификате анализа продукта. Пожалуйста, см. Список компонентов комплекта, чтобы определить компоненты комплекта. Сертификаты анализа и списки компонентов комплекта находятся на вкладке «Документы».

.